Способ количественного определения жирнокислотного состава липидов микроорганизмов

СОЮЗ СОВЕТСНИХИЗМЛЮВцЕПаРЕСПУБЛИК а С 12 1/ ЕН 3Ць Э П.Нечаев,ественскаяТрудовогоогическийьыиленности ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ИОМИТЕТ ССС У лАИ ауПВВЮ и бН(71) Московский орденаКрасного Знамени технолинститут пищевой про(56) 1.Андреев Л.В., Склифас А,Н.О хемотаксономических аспектах обмена бактерий. Сборник "Виохиюя и биоФизика микроорганизмов", Горький ГГУ, 1977, с, 3.2. Авторское свидетельство СССР И 968072, кл. С 12 Я 1/00, 1980.(54)(57) СПОСОВ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДИЗЖНИЯ ЗИРНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА ЛИПИДОВ ИИКРООРГАНИЗИОВ, предусмат" ривающий последовательнув. обработку . биомассы при нагревании ацетилхлоридом и метанолом при соотношении биомасса-ацетилхлорид-метанол 100;(50 -,60):(180-220), удаление жидкой Фазы,обработку сухого остатка гексаном ианализ гексановой вытяжки методомгазовой хроматографии, о т л и -ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюувеличения точности анализа, передобработкой биомассы ацетилхлоридомее подвергают обезвоживанию путемпоследовательного добавления ацетило .хлорида, нагревания при 50-52 С,добавления гептана н кипячения доудаления уксусной кислоты с последующим введением внутреннего стандартаи разделением реакционной смеси надве части, в одну из которых добавляют перманганат калия в количестве5-10 мг на 100 ип сухой биомассы,при этом соотношение биомасса-ацетил: хлорид-гептан составляет 1 А:(4,3 -4,8)А:(8,2-8,6)А, где А - влажностьбиомассы, Х,1 О 30 1Указанная цель достигается тем,что согласно способу количественного определения жирнокислотного сос отава липидов микроорганизмов, предусматривающему последовательнуюобработку биомассы при нагреванииацетилхлоридом и метанолом при соотношении биомасса-ацетил-хлоридметанол 100:(50-60):(180-220),удаление жидкой фазы, обработку сухого остатка гексаном и анализ гексаИзобретение относится к микробно.логической промышленности, а именнок способу количественного определения жирнокислотного состава липидовмикроорганизмов. 5Известен способ количественногоопределения жирнокислотного составалипидов,микроорганизмов, предусматривающий обработку биомассы при нагревании с последующим анализомреакционной смеси методом газовойхроматографии 1.Обработку биомассы ведут методомсопирализа, согласно которому .биомассу обрабатывают раствором гидроокиси тетраметиламиония и нагреваютпри 120-140 С, полученную реакциононую смесь подвергают пиролизу виспарителе хромаЭографа нагреоЭтом до 350 С. 20Недостатком данного способаявляется отсутствие возможностиколичественного определения нолиненасыщенных жирных кислот, чтоограничивает область применения способа определением жирнокислотногосоставабактерий, которые такиекислоты не содержат.Известен также способ количественного определения жирнокислотного состава липидов микроорганизмов, предусматривающий последовательную обработку биомассы при нагревании ацетилхлоридом и метанолом,при соотношении биомасса-ацетил- З 5хлорид-метанол 100:(50-60):(180-220)удаление жидкой фазы, обработку сухого остатка гексаном и анализ гексановой вытяжки методом газовой хроматографии 2 . , 40Недостатком известного способаявляется невысокая точность анализапри определении содержания жирныхкислот методом внутреннего стандарта, 45Цель изобретения - увеличение ф точности анализа. новой вытяжки методом газовой хроматографии, перед обработкой биомассы ацетилхлоридом ееподвергаютобезвоживанию путем последовательного добавления ацетилхлорида нагре-О9вания при 50-52, добавления гептана и кипячения до удаления уксусной кислоты с последующим введением внутреннего стандарта и разделением реакционной смеси на двечасти, в одну из которых добавляютперманганат калия в количестве5-10 мг на 100 мг сухой биомассы,при этом соотношение биомасса-ацетилхлорид-гептан составляет 1 А:(4,3 -4,8)А:(8,2-8,6)А, где А - влажность биомассы, Х,Способ осуществляют следующимобразом.Навеску влажных дрожжей обрабатывают ацетилхлоридом таким образом,чтобы весовое соотношение влаги,содержащейся в образце, и ацетилхлорида составляло 1:(4,3-4,8).Реакционную смесь нагревают при50-52 С, происходит реакция обраОзования уксусной кислоты и выделение НС 1. После этого добавляютгептан в количестве, превышающемсодержание влаги в образце в8,2-8,6 раза. Реакционную массунагревают при 92-95 С до удаленияоуксусной кислоты в виде азеотропас гептаном, После этого в сухойостаток добавляют внутренний стандарт (например, 0,2 мл 25 Х-гораствора арахиновой кислоты) и, разделив пробу на две части, в однудобавляют 5-10 мг перманганата калияв расчете на 100 мг сухой биомассы.Обе пробы подвергают обработкеацетилхлоридом и метанолом таким аВразом, чтобы соотношение сухая биомасса: ацеткпхлорнд:метанол составляло 100 з(50-60):(180-220). Жидкуюфазу упаривают на песчаной банепри 70-80 С. Сухой остаток в обеихопробах экстрагируют гексаном и гексановые вытяжки подвергают анализуна хроматографе,Нагревание влажной биомассы после внесения ацетилхлорида позволяет удалить влагу, содержащуюся в образце, путем взаимодействия ее с ацетилхлоридом. Последний превращается в уксусную кислоту, которая. удаляется в виде азеотропа с гептаном. Удаление воды при помощи химической ре,35 акции ускоряет процесс сушки образца и позволяет получить точные данные об абсолютном содержании жирных кислот в единице веса сухой биомассы. Деление образца после вне сения в него вн 5 реннего стандарта и обработка одной части образца перманганатом калия позволяет повыить точность анализа за счет обеспечения достоверной идентификации качественного состава жирных, кислот. Установлено, что оптимальным количеством перманганата калия является 5-10 мг на 100 мг. сухой биомассы,П р и м е р 1. Анализируют состав 15 жирных кислот липидов хлебопекарных дрожжей, выращенных на отходах производства этилового спирта. Влажность образца 65%, Влажность определяют в сушильном шкафу при 20 130 С доведением образца до постооянного веса. В круглодонную колбочку объемом 5 мл помещают точную навеску влажных дрожжей (0,3 г). Для связывания воды добавляют 0,85 г 25 ацетилхлорида (по отношению к воде 1:4,3). Колбочку с реакционной массой нагревают на песчаной бане при 50-52 С в течение 10 мин с воздуш-,оным хблодильником в виде шарика. 30 После этого добавляют по 1,60 г гептана ( по отношению к воде 1:8,2) и при нагревании на песчаной бане при 91-955 С удаляли уксусную кислоту, выделившуюся при взаимодействии ацетилхлорида с влагой образца, в ниде аэеотропа с гептаном. После упаривания жидкой фазы в колбочку добавляют 0,2 мй внутреннего стандарта (2%-ный раствор40 арахиновой кислоты в хлороформе), затем, разделив пробу на две части, . в одну добавляют 5 мг марганцевокислого калия, Содержимое обеих колбочекобрабатывают ацетилхлори дом (по 50 мг) и метанолом (по 255 мл), Жидкую фазу упаривают при 70-80 С на песчаной бане 1 ч. После упаривания жидкой фазы образовавшиеся метиловые эфиры экстрагируют 0,2 мл 50 гексана и гексановую вытяжку вводят в хроматограф с пламен- нО-ионизационным детектором марки ЛХИЯ. Анализ проводят в остальных колонках длиной 2 м, внутренним 55 диаметром 4 мм, заполненных твердым носителем хроматон Супер с 10% дизтиленгликольсукцинатом. Температура испарителя 22 ООС, температура термостата колонок 170 С. Газ носитель - гелий, расход через колонку 30 мл/мин, Соотношение рас" ходов гаэ - носитель: водород:воздух - 1: 1: 10.Хроматограммы метиловых эфиров жирных кислот рассчитывают методомвнутреннего стандарта. Полученные результаты представлены в табл. 1.Количественное содержание кислот, определенное по предлагаемому способу, в образце влажной биомассы хорошо соответствует контрольному определению, а обработка части пробы КМл 04 позволяет точно дифференцировать критические пары: С 15,иСМ.1 С 16:, н СИ;о ф Сгд.4 и С 22;0 Для пика, соответствукнцего первой паре, не обнаружено уменьшения его площади после обработки И 1 я 04, что указывает на присутствие кислоты С 1 б о. Для следующих двух критических пар уменьшение содержания вещества в пробе уменьшено, что означает наличие кислот С 16;4 и Сго;4П р и м е р 2. Анализируют состав жирных кислот липидов хлебопекарных дрожжей, выращенных на мелассе (отходы сахарного производства), Влажность образца 77%. Влажность эпределяют в сушильном шкафу при рысушивании влажного образца до постоянного веса. В круглодонную колбочку объемом 5 мл помещают 0,45 г влажного образца. Для .связывания воды добавляют по 1,б 0 г ацетилхлорида. Колбочку с содержимым нагревают с воздушным холодильником на песчаной бане 10 мин при 50-52 С для полного связывания воды.0После охлаждения в колбочку добавляют 2,90 г гептана. Колбочку помещают в песчаную баню с температурой 91-95 С до полного удаления укосусной кислоты. После этого в колбоЧку добавляют 0,2 мл внутреннего стандарта (2,5% раствор арахиновой кислоты в хлороформе) и разделив про-. бу на две части, в одну из них дополнительно вносят 10 мг марганцевокислого калия, Содержимое обеих колбочек после этого обрабатывают ацетилхлоридом и метиловым спиртом в тех же количествах и условиях, что и в первом примере. Анализ метиловых1089123 Таблица 1 Содержание кислот (мг)в расчете на 1 г сухойбиомассы 11 редполагаемый состав жирнокислотного с.,ектра (без дифференциации критических пар) Содержание кислот (мг) в 1 г лиофилизированной биомассы (контроль по прототипу) Уточненнййсостав жирнокислотногоспектра(определенопо предлагаемому способус обработкойпробы КИ 104)(определенов образцевлажной биомассы попредлагаемому способу с 0,1 с 0,1 СС 4;о с 0,1 с 0,1 с 0,1 с 01 с 0,1 с 0,1 с 0,1 0,13 0,12 сО, 1 с 0,1 с 0,1 3,48 С 1 бю 3,25 3,66 С 1 ь: а 16 м б,о 4 5,06 7,040,1 сО 1 С 16:2 2,03 1,97 2,01 6,37 9,84 9,36 0,08 0,36 0,45 эфиров проводят на хроматографе с соблюдением тех же условий, что и в первом примере.Полученные данные представлены в табл. 2. 5П р и м е р 3. Анализируют состав жирных кислот липидов дрожжей родаСапдЫа, выращенных на этаноле, Влажность образца 423. В круглодонную колбочку объемом 5 мл помещают навеску 0,15 г влажной биомассы, к которой добавляют расчет" ное количество ацетилхлорида (0,30 г). Смесь выдерживают 10 мин на песчаной бане при 50-52 С с обратным воэдушным холодильником. После этого реакционную массу охлаждают и добавляют 0,54 г гептана. Для удаления образовавшейся уксусной кислоты смесь нагревают при 92-95 С до ис 0 чезнования запаха уксусной кислоты. После удаления уксусной кислоты в колбочку добавляют внутренний стандарт (27,-ный раствор арахиновой кислоты в хлороформе) и, разделив пробуна две части, обрабатывают ацетилхлоридом (50 мг) и метанолом (2,5 мл),предварительно добавив в одну изних 7,5 мг КМя 04После упариванияжидкой фазы полученные метиловыеэфиры жирных кислот экстрагнруютгексаном (0,2 мл) и гексановую вытяж-ку вводят в хроматограф. Условия указаны в предыдущих примерах, Расчетполученных хроматограмм проводятметодом внутреннего стандарта.Полученные результаты представлены в табл, 3,Таким образом, предлагаемыйспособ количественного определенияжпрнокислотного состава липидов микроорганизмов позволяет повыситьточность анализа путем повышениядостоверности идентификации отдель"ных компонентов жирнокислотногоспектра.1089123 Продолжение табл. 1 Содержание кислот (мг)в расчете на 1 кг сухойбиомассы Уточненныйсостав жирнокислотно.го спектра5 18,8 а 2 Таб г) в биоСодержание кислотрасчете на 1 г сухмассы одержани ислот (м в 1 г офи но(контрольпо прото(определ по предл гаемому собу с боткой. бы КИНО ено(определен в образце влажной би массы по предлагаем му способу пектр спо- братип ро),3 0,4 14:о 5 0,46 44 О 0,37 Ео 8,8,59 6 Ь:0 8,32,0 2,91 э 17 4,5 Предлагаемый состав жирнокислотного спектра(без дифференциации критическихпар) Я Ненасьпценных кислот Предлагаемый состав жирнокислотного спектра (без дифференциации критических пар Содержание кислот (мг) в 1 г лиофилизированной биомассы (контроль по предлагаемому способу(определенов образцевлажной биомассы попредлагаемому способу Уточненныйсостав жирно.кислотного(нг)сухой ванне кЧеТЕ Нассы 0 к осции крпар) о а иу спасо О,0,1,2 0 4,4,5 6 5 ззредззолагаенВзй сос ф тав шзряокйслотнога спектра (без дифФе- РЕНЗЗИаЗЗИИ КРИТИЧЕС хих пар) Х Всех кис Е Насыщенных киСлот гаеицй с нокисло ектра рензЗи итичес кихтав аирного сп(без ди 4 фе Содержаниекислот (нгв 1 г лиофм иэирова биомассы (хаитрол ПО ПРОТО типу) Содержание кислот (мг в 1 г лиани зироваинойомассмонтролв еделеио аз 3 е ой био ПО агае 1пределе нобразцеайной б 3ссы иоедлагаеНУ СЯОСО определен о йредлаг еиому спо обу с обр откой про ы ВЬО,З) Уточяеянмйсостав яиряО"ХИСЛОТИОГОсззех тра Уточненный состав аир нокислотно го спектра,05 31,8 8 Ф 19 о 276 6 3,1 4 1,12 204 2,01 301,51 2,47 сех кислот васьценныхкислот 178,24 енесьпценньислот 123,07 42 237,Составитель Т.ИелентьеТехред М.ГергельШекмар Редактор Н.Ковале Коррек каз 2871/23ВН Тираи 522ИИПИ Государственногопо делам изобретений3035, Москва, Ж, Раушс одпис омитета СССоткрытийкая наб., д ПП "Патент", г. Уагород, ул. Проектная,фил Преднага евайсостае аирнокислотногоспектра (бездифференциациикритических аар) Содерианиекислот (мг)в 1 г лиофилизированнойбиомассы(оаределенов образцевлааиой биомассы аоаредиагаемому свособу оаределено о, предав= аемому саообу с обраоткой арф бм КМнО)