Способ получения иммобилизованной глюкоамилазы

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 4 С 12 М 11/О ГОСУДАРСТВЕННЫЙПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ ИПРИ П 1 НТ СССР ИТЕТ РЫТИЯ ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ АТЕН иОБИЛИЗ ОВАН биотехи ис нию обретение отн тся к биотехсти.Целью изобр чение активнос мобилизованнойСпособ полу тения является увелии и стабильности имглюкоамилазы.ения иммобилизованнойключается в повышенлюкоамилазы з помом зывании глюкоамилаз щью в с син мидаоснове орастворимого тическим носит н еля ис- сополиакрил польз а, в качестве н пористые грануль(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММНОЙ ПЦОКОАВИЛАЗЫ(57) Изобретение относится кнологии, а именно к получе нологии, а именно к получению иммобилизованных ферментов, и может бытьиспользовано в пищевой промьппленнопользованию иммобилизованных фермен тов, в частности глюкоамилазы. Цель изобретения - повышение активности и стабильности целевого продукта. Способ заключается в повышенном связывании с помощью водорастворимого карбодиимида глюкоамилазы.на сополиГмере акриламида, М,М -метиленбисакриламида и М-(аминоэтил)акриламида, содержащего 2,75 м.экв/г - МН-групп или из сополимера акриламида, М,М - метиленбисакриламида и акриловой кислоты, содержащего 1,0-7,49 м.зкв/г СООН-групп, размер пор которых не позволяет проникать в них веществам с мол.м, 100.000-300.000 дальтон.Связывание проводят при рН 4,5-9,0, температуре 0-4 С в течение 24-72 ч. Способ позволяет повысить активность иммобилизованной глюкоамилазы в 4 раза, а также ее стабильность в3 раза. мера акриламида, М,М ф-метиленбисак"риламида и М" (аминоэтил) акриламида,содержащего 2,75 Иэкв/г МН,-групп,или из сополимера акриламида, М,Мметиленбисакриламида и акриловойкислоты, содержащего 1,0-7,49 Мэкв/гСООН-групп, размер пор которых непозволяет проникать в них веществамс мол.м. 100.000-300.000 дальтон, асвязывание проводят при рН 4,5-9,0,температуре 0-4 С в течение 24-72 ч,полученный гель промывают буфером,неоднократно отмывают от солей водой и при желании лиофилизуют. Способ позволяет получить препаратыз 146ычмобилизованной глюкоамилазы с высокой стабильностью и активностью.П р и м е р 1. 0,5 г Асгь.1 ех Аксерогеля (связывающая способность,т.е. содержание ИН -групп 2,75 Мэкв/г,размер частиц 100.320 мкм) суспендируют в 25 мл 0,1 И к-фосфаты (рН7,0), добавляют 1,7 мг раствора глюкоамилазы (117,7 мг/мл) при перемешивании. Через 10 мин добавляют0,5 г И-циклогексил- М - Е 2-(4-морфолинил)этила-карбодиимида, растворенного в 25 мл холодного буфера (+4 С).При 0-4 С полное время реакции составляет до 48 ч, за это время смесьперемешивают два раза по б ч. Гельотделяют фильтрованием и трижды промывают 50 мл 0,1 М к-фосфата (рН7,0), трижды тем же буфером с добавлением 1 М,ИаС 1 (по 50 мл) и триждыпо 50 мл буфера ИаС 1. Затем промывают дистиллированной водой и модифицируют. Таким образом, получают 0,7 гиммобилизованной. глюкоамилазы с активностью 1,6 г глюкозы/ч г ксерогеля.П р и м е р 2, 0,5 г А 1 сг 1 ехСксерогеля (содержание СООНгрупп 6,2 Мэкв/г, размер частиц 100320 мкм) суспендируют в 50 мл 0,1 Мбуфера ацетата натрия (рН 4,5) идобавляют 1 г карбодиимида. Далееспособ осуществляют по примеру 1,заменяя к-фосфат на 0,1 М ацетатнатрия с рН 4,5. Получают 0,7,г иммобилизованной глюкоамилазы с активностью 0,85 г глюкозы/чг ксерогеля.П р и м е р 3. Ведут опыт попримеру 2 за исключением того, чтореакцию ведут 24 ч. Выход: 0,65 гиммобилизованной глюкоамилазы. Активность: высвобождается 0,79 г глюкозы/чг ксерогеля.Приме р 4. Ведут опыт попримеру 2 за исключением того, чтореакцию ведут в течение 72 ч. Выход:0,63 г иммобилизованной глюкоамилазы. Активность: высвобождается,0,82 г глюкозы/чг ксерогеля,П р и м е р 5. 0,5 г АЕг 3.1 ехС.ксерогеля (связывающая активность, т.е. СООН-содержание,6,2 Мэкв/г, размер частиц 100 -320 мкм) суспендируют в 50 мл 0,1 Мбуфера ацетата натрия (рН 5,0), после чего добавляют 1 г Б-циклогексил-Б -",2-(4-морфолинил)-этил 1-карбодиимид-метил-пара-тдлуолсульфоната на 13734охлаждаемой льдом бане при постоянном перемешиванни, Реакционную смесьперемешивают в течение 10 мин, после чего добавляют 1,6 мл раствораглюкоамилазы (117,7 мг/мл) и рН ре-акционной смеси устанавливают 4,5.оПри 0-4 С, полное время реакции составляет до 48 ч за это время суспензию дважды перемешивают в течениеб ч каждый раз, рН контролируют вначале каждого получаса, а затем раэв час и в случае необходимости доводят до нужного значения, После эа вершения реакции гель удаляют фильтрацией и трижды промывают порциямипо 50 мл 0,1 М буфера ацетата натрия(рН 5,0), трижды порциями по 50 мл1,0 М буфера ацетата натрия, содержащего 1,0 моль хлористого натрия,каждая (рН 5,0), и трижды порциямипо 50 мл 0,1 М буфера ацетата натрия(рН 5,0). В конце гель промывают дополного удаления соли дистиллирован ной водой и лиофилизируют. Таким образом, получают 0,7 г. иммобилизованной глюкоамилазы. Активность: 0,75 г.П р и м е,р 6. 0,5 г А 1 сг 1 ехС00 ксерогеля (связывающая спо- ЗОсобность, т.е. СООН-содержание,6,2 Мэкв/г, размер частиц 100320 мкм) суспендируют в 50 мл 0,1 Мбуфера ацетата натрия(рН 6,0), после.чего добавляют 1 г И-циклогексил"И " 35- 2-(4-морфолинил)-э тил 3-карбодиимид-метил-пара-толуолсульфоната на водяной бане со.льдом при постоянном перемешивании, Реакционную смесь перемешивают в течение 10 мин, после че го добавляют 1,7 мл раствора глюкоамилазы (117,7 мг/мл) и рН реакционной смеси устанавливают 6,0. При Оо4 С время до завершения реакции составляет до 48 ч, за это время сус пензию дважды перемешивают по 6 чкаждый раз, рН контролируют в началекаждого получаса и затем один раз вчас, а в случае необходимости доводят до нужного значения. После завершения реакции гель удаляют фильтрованием и трижды промывают порциямипо 50 мп 0,1 .М буфера ацетата нэгрия (рН 6,0), трижды порциями по50 мл 1,0 М буфера ацетата натрия,содержащего 1,0 моль хлористого нат,рия каждый,(рН.6,0), и триждь порциями по 50 мл.0,1 М буфера ацетатанатрия (рН 6,0), В конце гель промы ,вают. , до полного удаления солй73 ток суспензию дважды перемешивают по6 ч каждый раз, рН контролируют вначале каждого получаса, а позднеераз в час, в случае необходимостидоводят до нужного значения, Послезавершения реакции гель удаляютфильтрованием и трижды промывают .порциями по 50 мл 0,1 М буфера ацетата натрия (рН 7,5), трижды порциями по 50 мл 1,0 М буфера ацетата натрия, содержащего по 1,0 хлористогонатрия каждая (рН 7,5), и трижды порциями по 50 мл 0,1 М буфера ацетатанатрия (рН 7,5), В конце гель промывают до полного удаления соли дистиллированной водой и лиофилизируют. Врезультате получают 0,75 г иммобилизованного геля. Активность: вьщеляется 5,7 г глюкозы/чг ксерогеля.П р и м е р 9. 0,5 г А 1 сгд 1 ехСксерогеля (связывающая активность, т.е. СООН-содержание,6,2 Мэкв/г, размер частиц 100 -320 мкм) суспендируют в 50 мл 0,1 Мбуфера ацетата натрия, после чего(добавляют 1 г И-циклогексил-М -с 2-(4-морболинил) -э тил 3-к арбодиимид-пара-толуол-сульфоната в водянойбане со льдом при постоянном перемешивании. Реакционную смесь перемешивают в течение 10 мин, после чегодобавляют 1,7 мл раствора глюкоамилазы (117,7 мг/мл) и рН реакционной смеси устанавливают 8,0. Прио0-4 С время до завершения реакциисоставляет до 48 ч, за этот промежуток суспензию дважды перемешиваютпо 6 ч каждый раз, рН контролируютв начале каждого получаса, а затемодин раэ в час, в случае необходимости доводят до нужного значения. После завершения реакции гель удаляют .фильтрованием и трижды промываютпорциями по 50 мл 0,1 М буфера ацетата натрия (рН 8,0), трижды порциями по 50 мл 1,0 И буфера ацетата натрия, содержащего по 1,0 моль хлористого натрия каждый (рН 8,0), и трижды порциями по 50 мл 0,1 молярногобуфера ацетата натрия (рН 8,0). Вконце гель промывают до полного уда"ления соли дистиллированной водой илиофилизируют. Таким образом, получают 0,65 г иммобилизованной глюкоамилазы. Активность: 3,9 г глюкозывысвобождается/ч.г ксерогеля,П р и м е р 10, 0,5 г А 1 сг 11 ехСксерогеля (связывающая способ-,5 14613 дистиллированной водой и лиофилизируют, Таким образом, получают 0,7 г иммобилизированной глюкоамилазы. Активность: высвобождается 1 35 г глюУ5 козы/ч г ксерогеля.И р и м е р 7. 0.5 г А 1 сг 1 ех Сксерогеля (связывающая активность, т,е, СООН-содержание, 6,2 Мэкв/г, размер частиц 100-320 мкм/ О суспендируют в 50 мл 0,1 М буфера ацетата натрия (рН 7,0), после чего добавляют 1 г И-циклогексил-И -2-(4- -морфолинил) в эти-карбодиимид-метил-пара-толуолсульфоната на бане с ледяной водой при постоянном пере- . мешивании. Реакционную смесь переме-шивают в течение 10 мин, после чего добавляют 1,7 мл раствора глюкоамилазы (117,7 мг/мл) и рН реакционной 20о смеси устанавливают 7,0. При 0-4 С полное время реакции составляет до 48 ч, за это время суспензию перемешивают дважды по б ч каждый раз, рй контролируют в начале каждого получа , са, затем каждый час, а в случае необходимости доводят до нужного значения. После завершения реакции гель удаляют, фильтрованием и трижды промывают порциями по 50 мл 0,1 М буфе" 3) ра ацетата натрия (рН 7,0), трижды порциями по 50 мл 1,0 М буфера ацетата натрия, содержащего по 1,0 моль хлористого натрия (рН 7,0), и трижды порциями по 50 мл 0,1 М буфера ацетата натрия (рН 7,0). В конце гель промывают до полного удаления соли дистиллированной водой и лиофилизируют, Таким образом получают 0,6 г иммобилизованной глюкоамилазы. Ак тивность: высвобождается 3,0 г глюкозы/ч г ксерогеля.П р и м е р 8, О 5 г А 1 ст 1 ех Сксерогеля (связывающая ак- тивность, т,е. СООН-содержание, 45 6,2 Иэкв/г, размер частиц 100. - 320 мкм) суспендируют в 50 мл 1,1 М буфера ацетата натрия (рН 7,5), после чего добавляют 1 г И-циклогексил 1-И -Г 2- (4-мо рфолинил) -э тил 3-карбоди 50 имид-метил-пара-толуолсульфоната в на водяной бане со льдом при постоянном перемешивании. Реакционную смесь перемешивают в течение 10 мин, после чего добавляют 1 7 мл раствора глюкоЭ. 55 амилазы (117,7 мг/мл) и рН реакцион-. ной смеси устанавливают до 7,5. При 0-4 С время до завершения реакции составляет до 48 ч и за этот промежу 146137но сть, т. е, СООН-содержание,6,2 Мэкв/г, размер частиц 100 -320 мкм) суспендируют в 40 мл 0,1 Мбуфера ацетата натрия (рН 8,5), после5чего добавляют 1 г М-циклогексил-И -- 2-(4-морфолинил)-этила-карбодиимид-метил-пара-толуолсульфоната в банес ледяной водой при постоянном пере"мешивании. Реакционную смесь перемешивают в течение 10 мин, после чегодобавляют 1,7 мл раствора глюкоамилазы (117,7 мг/мл) и рН реакционнойосмеси устанавливают ,5. При 0-4 Свремя до завершения реакции составляет до 48 ч., за это время суспензиюперемешивают дважды по б ч каждыйраз, рН контролируют в начале каждого получаса, а затем один раз в час,в случае необходимости доводят донужного значения. После завершенияреакции гель удаляют фильтрованиеми трижды промывают порциями по 50 мл0,1 М буфера ацетата натрия (рН 8,5),трижды по 50 мл 0,1 М буфера ацетата 25натрия, содержащего 1,0 моль хлористого натрия (рН 8,5), и трижды порциями по 50 мл 0,1 М буфера ацетата натрия (рН 8,5). В конце гельпромывают до полного удаления соли 30дистиллированной водой и лиофилизируюте Таким образом, получают 0,7 гиммобилизованной глюкоамилазы. Ак,тивность: высвобождается 2,2 г глюкозь 17 чг ксерогеля,П р и м е р 11, 0,5 г А 1 сгх 1 ехСксерогеля (связывающая способность, т.е, СООН-содержание,6,2 Мэкв/г, размер частиц 100 -320 мкм) суспендируют в 50 мл 0,1 Мбуфера ацетата натрия (рН 9,0), после чего добавляют 1 г И-циклогексил-М -12-(4-морфолинил)-этил 1-карбоди/имид-метил-пара-толуолсульфоната вводяной бане со льдом при постоянномперемешивании. Реакционную смесь перемешивают в течение 10 мин, послечего добавляют 1,7 мл раствора глюкоамилазы (117,7 мг/мл) и рН реакционной смеси устанавливают 9,0. При0-4 С время до завершения реакциисоставляет до. 48 ч, за этот промежуток суспенэию -дважды перемешивают по6 ч каждый раз, рН контролируют вначале каждого. получаса, затем каждого часа, а в случае необходимостидоводят до нужного значения. Послезавершения реакции гель удаляют фильтрованием и трижды промывают порци 3 8ями по 50 мл 0,1 М буфера ацетатанатрия (рН 9,0), трижды порциями по50 мл 1,0 М буфера ацетата натрия,содержащего по 1,0 моль хлористогонатрия каждый (рН 9,0) и трижды пор"циями по 50 мл 0,1 М буфера ацетатанатрия (рН 9,0). В конце гель про-мывают до полного удаления соли дистиллированной водой и лиофилизируют,Таким образом, получают 0,8 г иммобилизованной гюпокоамилазы.Активность: высвобождается 1,25 гглюкозы/ч г ксерогеля,П р и м е р 12. 0,5 г А 1 сг 1 ехСксерогеля (связывающая способность, т,е. СООН-содержание,6,2 Мэкв/г, размер частиц 100 -320 мкм) суспендируют в 50 мл 0,1 Мбуфера фосфата калия (рН 7,5), .после,чего добавляют 0 5 г Б-циклогексилУ-Б -Г 2-(4-морфолинил)-этила-карбодиимид-метил-пара-толуол-сульфонатав водяной бане со льдом при постоянном перемешивании. Реакционную смесьперемешивают в течение 10 мин, после чего добавляют 2 мл раствора глюкоамилазы (125 мг/мл) и рН реакционной смеси устанавливают до 7,5. Прио0"4 С время до завершения реакциисоставляет до 48 ч. Далее проводятобработку по предыдущему примеру.Получают 0,65 г препарата с активностью 1,3 г глюкозы/чанг,П р и м е р 13. Проводят иммобилизацию по примеру 12, используя01 М к-фосфат (рН 7,5). Получают0,6 г иммобилизованной глюкоамилазы.Активность; выделяется 2,08 г глюкозы/ч г ксерогеля,П р и м е р 14. 0,5 г АКг 11 ехСксерогеля (связывающая активность, т.е. СООН-содержание,6,2 Мэкв/г, размер частиц 100 -320 мкм); суспендируют в 50 мл 0,1 Мбуфера фосфата калия (рН 7,5), послеГчего добавляют 1 г Б-циклогексил-Х --Г 2-(4-морфолинил)-зтил 1 карбодиимид-метил-пара-толуолсульфоната в водяной бане со льдом при постоянном перемешивании, Реакционную смесь перемешивают в течение 1 О мин, послечего добавляют 1,7 мл раствора глюкоамилазы (117,7 мг /мл) и рН реакционной смеси устанавливают 7,5. Прио0-4 С полное время реакции составляет до 48 ч, за этот промежуток суспензию перемешивают дважды по 6 чкаждый раэ. В начале реакции рН контролируют каждые полчаса, затем каждый час, а в случае необходимостидоводят до нужного значения. Послезавершения реакции гель выделяютфильтрованием и трижды промывают порциями по 50 мл 0,1 М буфера фосфатакалия (рН 7,5), трижды порциями по50 мл 0,1 М буфера фосфата калияЬ)содержащего по 1 моль хлористого натрия каждый (рН 7,5), и трккды порциями по 50 мл 0,1 М буфера Фосфатакалия (рН 7,5). Полученный гель вконце промывают от соли дистиллированной водой и лиофилизируют, Таким 15образом, получают 0,7 г иммобилиэованной глюкоамилазы. Активность: выделяется 4,7 г глюкозы/ч г ксерогеля.Приме р 15. 05 г А 1 ст.1 ехСксерогеля (связывающая способность, т.е. СООН-содержание,7,49 Мэкв/г, размер частиц 120 -320 мкм) суспендируют в 100 мл 0,1 Мбуфера фосфата калия (рН 7,5), послечего добавляют 1 25 г И-циклогексилФ-Н - 2-(4-морфолинил) этила-карбодиимид-метил-пара-толуолсульфоната вводяной бане со льдом при постоянном( перемешивании. Реакционную смесь перемешивают в течение 1 О мин, после чего 30добавляют 2,6 мл раствора глюкоамилазы(120 мг/мл) и рН реакционной смеси. устанавливают 7,5. При 0-4 С времяреакции до ее завершения составляет48 ч, за этот промежуток времени сус- ЗБпензию перемешивают дважды по 6 чкаждый раз. В начале реакции рН контролируют каждые полчаса, позднеекаждый час, а рН в случае необходимости доводят до нужного значения. 40После завершения реакции гель выделяют фильтрованием и трижды промывают порциями по 100 мл 0,1 М буферафосфата калия (рН 7,5), трижды порцйями по 100 мл 0,1 М буФера фосфата калия, содержащего по 1 моль хлористого натрия (рН 7,5), и триждыпорциями по 100 мл 0,1 М буфера фосфата калия (7,5 рН). В конце полученный гель промывают до полного уда- уления соли дистиллированной водойи лиофилизируют. Таким образом, получают 0,7 г иммобилизованной глюкоамилазы. Активность: выделяется765 г глюкозы/чанг ксерогеля,П р и м е р 16. 0,5 г А 1 сгд 1 ехСксерогеля (связывающая способ.ность, т,е, СООН-содержание,7,83 Мэкв/г, размер частиц 40 -463731 О120 мкм) суспендируют в 150 мл О, 1, Мбуфера Фосфата калия (рН 7,5), послечего добавляют 1,2 Г Б-циклогексил(-И - 2-(4-морфолинил)-этил-карбодиычид-метил-пара-толуол-сульфоната вводяной бане со льдом при постоянномперемешивании. Реакционную смесь перемешивают в течение 1 О мин, послечего добавляют 2,55 мл раствора глю-.коамилазы (120 мг/мл) и рН реакционной смеси устанавливают 7,5. При 04 С время завершения реакции составляет по 48 ч, причем во время этогопромежутка суспензию перемешиваютдважды по 6 ч каждый раз, В началереакции рН контролируют каждые полчаса, позднее один раз в час, а вслучае необходимости устанавливаютдо нужного значения. После заверше"ния реакции гель выделяют фильтрованием, трижды промывают порциями по150 мл 0,1 М буфера фосфата калия(рН 7,5), трижды порциями но 150 мл0,1 М. буфера фосфата калия, содержащего по 1 моль хлористого натрия(рН,5), и трижды порциями по 150 мл.0,1 М буфера фосфата калия (рН 7,5).В конце гель промывают до полногоудаления соли дистиллированной водой,и лиофилизируют. Таким образом, получают 0,7 г иммобилизованной глюко"амнлазы, Активность: высвобождается8,4 г глюкозы/чг ксерогеля,П р и м е р 17. Способ осуществляют по примеру 16, но используют0,1 ч А 1 сг 1 ех Сксерогеля.с содержанием СООН-групп 0,47 Мэкв/г и0,2 г карбодиимида. Выход; 0,25 гиммобилизованной глюкоамилазы с активностью 0,09 г.ч на 1 г ксерогеля,П р и м е р ы 18-22. Иммобилизацию проводят по примеру 17, ноиспользуют ксерогель с содержаниемСООН-групп 2,2 (пример 18); 3,8(пример 21), 6,7 (пример 22) Иэкв/г.Выход к активность по примерам равны; 0,12 г и 2,1 г глюкозы/чг(пример 18), О, 13 г и 4, 1 г глюкозы/сг (пример 19),0,19 и 7,7 гглюкозы/ч .г (пример 20), 0,16 г,9 г/ч,г (пример 21) и 0,23 г и 20,2 гглюкозы/ч г носителя (пример 22).П р и м е р 23, Проводят иммобилизацию глюкоамилазы по примеру 1 О,но при рН 7,5, а также иммобилизацию глюкоамилазы в тех же условияхна биогеле СМ(известным спосо14 Ф о р м у л а и з о б р е т е н н я Способ получения иммобилизованной глюкоамилазы путем ее ковалентного связывания с помощью водорастворимого карбодиимида с синтетическим ноСоставитель Н. РыбальскийРедактор И. Шулла Техред Л, Олийнык Корректор В. Гирняк Заказ 548/59 Тираж 500. Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ .СССР 11303.5, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 бом), В обоих случаях связывается сходное количество глюкоамилазы по белку, но активность связанного фермента в процентах по предлагаемому и известному способам составляет 158 и 2,83. Время полу нактивации (при 60) препарата по предлагаемому и известному способам равно соответственно 90 и 28 мин.Таким образом, изобретение позволяет получать препараты иммобилизованной глюкоамилазы с более высокой активностью и стабильностью,6 37312сителем на основе акриламида, о тличающийсятем, что, сцелью повышения активности и стабильности целевого продукта, в каче"стве носителя используют пористыегранулы из сополимера акриламида,И,Н -метиленбисакриламида и Н-(аминоэтил)акриламида с содержанием 0 Я 1 О групп 2,75 Мэкв/г или из сополимераакриламида, И,Н -метиленбисакрилами.да и акриловой кислоты с содержанием СООН-групп 1,0 - 7,49 Иэкв/г,размер пор которых не позволяет проч 15 никать в них веществам с мол.м.100.000-300.000 дальтон, а связывание проводят при рН 4,5 - 9,0, температуре О - 4 С в течение 24 - 72 ,полученный гель фильтруют и промыва"ют неоднократно буфером с рН 4,59,0 и дистиллированной водой.