Способ очистки биологического материала

Номер патента: 710504

Авторы: Гудрун, Ларс-Олов, Хокан

ZIP архив

Текст

О и-тт"с-тс-к и. е ЯЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советскни Сецналнстттчеектт к Республик(23) Приорнтет - (32) 09 .07.75 Государственный квинте ссср но ледам нтнбретеннй н открытий(72) Авторы изобретения Иностранцы Ларс-,Олов Андерссон, Хокан Гуннар Ворг н Гудрун Моника ЭйнарссонИностранная фирмаАктиеболагет Кабит (Швеция)(54) СПОСОВ .ОЧИСТКИ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ОТ ВИРУСА ГЕПАТИТА ВИзобретение относится к медицинской промышленности и касается очисткИ биологического материала,Известен способ очистки биологического материала от вируса гепатй - та В путем сорбции исходного материала, преимущественно крови, на сорбент 11).Однако известный способ является трудоемким и не обеспечивает высокой степени очистки.Целью изобретения является повышение степени очистки и упротаение способа.Эта цель достигается тем, что в качестве сОрбеита используют водо" нерастворимую мат(тицу кавалентно связанную посредством таких групг;какЮО"с"нй -О-с-ий-ион кмй . нн ни(сн 1 ытт з аь т С ин члч мН сО Щ с гндрофьбным лнганлом.Кроме Того, в каче:тве водонерастворимой матрицы используют сефарозу.4 й В качестве сорбента использую;водонерастворнмую Матрицу в видевысокомолекулярного карбогидратаили пластичного вещества, ттесущегогндрообный лиганд, состоящий нзуглеродной цепи, содержащей более 7атомов углерода,или иэ системы кондеисированных ядер,В качестве матрицы в сериях нс"пользуют сеФарозу 4 В а в качествеПример 1. Удаление АОантигена из плазмы в результатеабсорбцией коньюгатом.В Качестве матрицы используют сефароэу, а в качестве лиганда этилендиамин-октилянтарную кислоту.5Получение гель-производного.Активацию сефарозы осуществляюттщательным промыванием 100 мл седиментированной сефароэы 4 В водой, Затемизбыток жидкости удаляют фильтрациейна фильтре, работающем под разрежением перед тем, как гель переносятв раствор 4 г цианогенбромида в100 мл дистиллированной воды.После установления равновесияв течение 15 мин при перемешивании 5и охлаждении в бане со льдом суспензию геля активируют при РН 11 втечение 6-7 мин, Величину РН поддерживают постоянной добавлением 4 Мраствора гидроокиси натрия. . 2 ОДля сочетания этилендиамина активированный гель промывают на стеклянном Фильтре холодным 0,5 М раствором натрий бикарбоната-карбоната приРН 9,8, перед тем как его переносятв раствор 10 г этилендиамина в 100 млдистиллированной воды, РН которойустанавливают равной 9, 8 с помощьюконцентрированной хлористоводороднойкислоты. Реакционную смесь оставляютпри перемешивании н течение 20 чпри комнатной температуре. Полученный.в результате гелевый продукт тщательно промывают.25 мл водной суспензии полученногов результате вспомогательного гелясуспендируют в 20 мл диоксана. По каплям добавляют свежий раствор б г октилянтарного ангидрида в 60 мл диоксанапри перемешивании, при комнатной температуре, РН поддерживают 7,5-8 добавОлением разбавленного раствора гидроокиси натрия, Адсорбент тщательнопромывают диоксаном, смесью диоксана и воды (2:1), водой, 1 М раствором хлористого натрия и буфером, 4состоящим из 0,05 М трио-буфера,0,02 М ци .рата натрия и 0,10 М хлористого натрия, при РН 7,5,Выход реакции сочетания в расчете на октилянтарную кислоту опреде Оляют методом ЯМР, он составляет4,8.Этилендиамин может быть замененна 1,4-диамивобутан и 1,б-диаминогексан с получением эквивалентныхРезультатов,Испытание на антиген.В качестве исходного материалаиспользуют плазму с положительнойреакцией на антиген с титром 1:64и 1;32. 6 ОЗначения титра приведены относительно стандарного антигена.В каждую из б трубок добавляют 2 млантигена-положительной плазмы и 2 млсуспензии, состоящей из 3 ч. тщательно 65 седиментированного адсорбента, уравновешенного испытательным буфероми .1 ч,этого буфера. Образцы двигаютв течение 1,2,5,10,20 и 30 мин соответственно и гели отделяют центриФугированием, Исследование верхнихслоев на присутствие антигена даетотрицательную реакцию.П р и м е р 2, Удаление Ао-антигена из плазмы в результатеадсорбции коньюгатом сефаооза- (гексаметилендиамин-додецилянтарная кислота).Получение гель-производного,Для сшивания сефарозы 100 мл гелясмешивают с 2 мл эпихлоргидрина и0,5 г борогидрата натрия, Смесьперемешивают при 60 С в течение .1 ч,Гель тщательно проьивают теплойводой и смешивают с раствором 0,25 гнатрий-борогидрида, растворенногов 50 мп 2 М гидроокиси натрия, Смесьпомещают в автоклав при 120 С на1 ч. Затем гель промывают щелочнымраствором борогидрата натрия. Медленно добавляют концентрированнуюуксусную кислоту до РН 4. Затем гельпромывают достаточным объемом воды.Получение вспомогательного геля изсефарозы и гексаметилендиамина проводят по методике примера 1.25 мл полученного вспомогательногогеля переносят на стеклянный фильтр ипроьывают смесью диоксана и воды (2:1)перед сушкой на фильтре с разрежениеми переносом в свежий раствор 1 гдодецилянтарной кислоты, 1,5 г водного растворимого карбодиимида, М -цик/логексил- Х (8-метилморфолиноэтил)-карбодиимид-и-толуил сульфонат в60 мл смеси диоксана и воды (2;1),Смесь перемешивают при комнатнойтемпературе в течение 1 ч перед перенесением на стеклянный фильтри тщательной промывкой диоксаном,смесью диоксана и воды (2:1), 1 Мраствором хлористого натрия, водойи испытательным буфером.Выход реакции сочетания в расчетена используемую жирную кислоту пометоду ЯМР составляет 2,0.Испытание на Ао-антиген.Плазму с положительной реакциейна Ао -антиген, имеющую титр 1:128,используют в качестве исходноговещества. Колонку набивают гель-производным, уравновешенным испытательнымбуфером. 7 мл плазмы с положительнойреакцией на АО-антиген с помощьюнасоса приводят в контакт с гелем(скорость подачи антигена 5 мл/ч).Испытательный буфер добавляют допрекращения элюирования протеиновогоматериала,что устанавливают Уф-сканированием.Собранный элюат имеет отрицательную реакцию, С помощью диалиэапод давлением элюат концентрируют в10 раз и он сохраняет отрицательнуюреакцию на гепатит.50 60 65 П р и м е р 3. Удаление АО-антигена из плазмы адсорбцией на коньюгат сефароза-каприлгидразид,Получение гель-производного,Этилкаприлат переносят и соответствующий гидразид с помощью гидразинолиэа. 10 мл этилового эфира смешивают с 10 мл 98-ного гидразин гидрата. В качестве растворителя добавляют этанол (22 мл) до осветленияреакционной смеси, после чего раствор оставляют при комнатной температуре на 15 ч. Закристаллиэованный гидразид отфильтровывают и проьывают ледяной водой и водным раствором метанола (1:1) при комнатнойтемпературе.15Сефарозу 4 В активируют по приме 1Гель проьывают раствором агентасочетания и сушат в вакууме. Сочетание осуществляют н результате пере- Яносаактивированного геля в 100 млнасыщенного раствора каприлгидразида, растворенного н диметилформамиде(1:1), Значение рН остается неизменным н ходе реакции сочетания,которую осуществляют при перемешивании при комнатной температурев течение 15 ч, Полученный в результате продукт тщательно проьввают ДМФ, ЗОсмесью ДМФ и воды (1:1), 1 М хлористым натрием, водой и испытательнымбуфером.Выход реакции сочетания в расчетена гидразид по методу ЯМР составляет2,3,Испыт ание на Ац -анти ген.В качестве исходного вещества используют плазму с положительной реакцией на Ац-антиген с титром 1:128. К2 мл суспензии, состоящей из 3 ч.тщательно седиментированного адсор-.бента, уравновешенного испытательнымбуфером, и 1 ч. этого буФера, добавляют 2 мл АО-антиген-положительнойплазжг. Смесь мягко перемешивают в 45течение 30 мин и гель отделяют центрифугиронанием. Верхний слой имеетотрицательную реакцию на Ао -антиген. П р и м е р 4, Удаление А 0-антигена из раствора альбумина путемадсорбции на коньюгат сефароза-(этилендиамин-октилянтарная кислота),Получение гель-производного.Геленый коньюгат получают в соответствии с примером 1,Испытание на Ао-антиген.Раствор альбумина с положительной реакцией на АО-антиген с титром1:64 и полученный н ходе фракционирбвания антиген положительной плазмыиспользуют в качестве исходного материала. Адсорбцию проводят периодически согласно примеру 3. Верхнийслой испытывают на антиген, получаютотрицательную реакцию; П р и м е р 5. Удаление АО-антигена из концентрата с коэффициентомкоагуляции в результате адсорбциина коньюгат сефарэза-(этилендиамин-октилянтарная кислота).Получение гель-производного.Гелевый коньюгат получают согласно примеру 1.Испытание на Ац -антиген.Антиген-положительную плазмуиспользуют для фракционирования концентрата, включающего коэффициентыкоагуляцииГотонят 1-ный протеиноный раствор, который имеет титр антигена 1:32, На стеклянный фильтрсо слоем из 5 мп гель-производного,уравновешенного испытуемым буфером,.добавляют 10 мл протеинового испыта"тельного раствора и гель промывают3 х 5 мл испытательного буфера. Элюаты исследуют на Ао -антиген, получают отрицательную реакцию,П р и м е р б. Удаление антиге.на из плазмы адсорбцией на коньюгатсефароза-тетрадециламин.Получение гель-производного.Сефарозу активируют в соответствиис примером 1,Для реакции сочетания 100 мп сефарозы, актиниронанной цианогенбромидом, которую уравновешивают 95-нымэтанолом и сушат на фильтре под разрежением, добавляют краствору 22 гтетрадециламина н 100 мл 95-ногоэтанола. Смесь оставляют при комнатной температуре при перемешиваниина 48 ч. Гель тщательно. промываюттеплым 95-ным этанолом, водным раствором этанола (1:1), 1 М растворомхлористого натрия, водой и испытательным буфером, Выход реакции сочетания по методому ЯМР составляет4, 3.Испытание на АО -антиген,В качестве исходного. веществаиспользуют АО-антигенположительнуюплазму с,титром 1:128, На стеклянный фильтр со слоем из 10 мл гель- .проиэводного, уравновешенного в испытательном буфере, добавляют 35 млплазмы, Материал промывают 3 х 10 .млиспытательного буфера и элюаты исследуют на Дц -антигенЭлюаты даютотрицательную реакцию. П р и м е р 7, Удаление ДН-анти" гена из плазмы адсорбцией на коньюгат сефароза-аминододекан.Получение гель-производного.2-Додекан превращают в соответствующий амин реакцией с гидроксил" амином с получением соответствующего оксима с последующим каталитическим гидрированием и элиминированием воды. Сефарозу используют в соответстнии с примером 1.Для сочетания 100 мп геля, акти- . нированного цианогенбромидом, промы вают 95-ным этанолом, подвергают сушке на фильтре под разрежением я до бавлявт к рв.створу 10 г 2 амико-доДекана в. 10 С мл 95-ного зтанола,Смесь оставляют стоить при пере,мешиваиии при комнатной температуре в течение 46 ч, после чего гель тщательно проьаВайт теплым 95%-ным зтаиолом, водным раствором этанола (111), 1 Я раствором хлористого натрцй водой к испы 1 ательным буферомрВыход реакции сочетания по методу, ЯИР составляет 1,0.Испытание на Ао-антиген. 3 качестве исходного материала используют Ац-антиген-полоаительнувплазму с титром 1:128,Опыт проводятсогласно примеру 3,верхний спой даетсФрицательнув реакцию,П р И м е р 8. Уцаленне М -антвгена из плазмы адсорбцией на коньюгатсефароза-(зтилендиамииундецен- 36-кислотаПолучение гель-производного.Систему сефароза-этилендиамин полуЧают согласно примеру 1. К свежемуРаствору 1,85 г ундециленовой кнсЛОтЫ Яи 2,1 г дициклогексилкарбодиимнда,растворенному в 100 мл диоксана, добавляют 100 мл коньюгата сефароза-зтилеидиамин с последующим уравновешиванием диоксаном и Фильтрацией в %;)Вакууме. Гепевую суспензию оставляютгри пеоемешивании на 15 ч при комнатной температуре, проявит диоксаном, смесьв диоксава и воды (111)1 И раствором хлористого натрия и испытательным буфером,Выход реакции сочетания в расчетена жирную кислоту по методу ямРсоставляет 2,3%.Испытание на Ао- антиген.В качестве. исходного вещества "Оиспользуют А 11-антиген;положительнуюплазму с титром 11128. Опыт проВОДЯтсогласно примеру 3, Было обнаружено,что верхний слой имеет отрицательнуюреакцию на антиген, 4П р и м е р 9. Удаление Ау-антигена из плазминогенного концентратаадсорбцией на коньвгат сефароза-каприлгидраэид.Пою 1 учение гель-производного,Релевый коиьвгат получают согласно. Примеру 3,Испытание иа Ацантигеи.Х 2 мл плазминогенного растворадобавляют 0,5 мл плаэюе с высоким усодержанием антигена, и эта смесьдает положительную реакцию на антигеи, Смесь пропускают через колонкувысотой 4 см, загруженную 10 мп"П р и м е р 10, Удаление Ац-анТйгена из плазмы адсорбцией на Ы коиьюгатполиакриламид-(пропилендециламин )Получение гель-производного,Лопиакрипамнд В 1 орб 1 Р 300 остав-.ляют набухать в воде и тщательнопромывают 0,05 И раствором натрийФосфатного буфбера с рН 7, Для аахти"вации процесса 20 мл гелевой суспеи"зии в буфере (0,5.сухого геля/25 млбуфера) смешивают с 5,0 мл глутарово.го альдегида и инкубируют при 37 С.и течение 18 ч. После этого гельтщательно прОмывают диоксаному смесью диоксана и воды (312),водой и ис.йятательным буфером.испытание на А 11 - антиген.Антиген-положительную плазмуо титром 11128 используют в качествеИсходного вецества. Опыт проводятсогласно примеру 3. При испытанииВЕРХНЕГО слоя было обнаружено, чтоон отрицателен,)1 р и и е р 11, Удаление А 11-антигена иэ плазмы адсорбцией на коньюгат сефароза-(цистеаминоктилянтарнаякислота).Получение гель-производного.Систему сефароза-цистеамин получают восстановлением сефарозацистамина,который получают согласно примеру 1в присутствии 0,05 М меркаптоэтанола в 0,1 И карбонатном буфере ПриРН 8;5 в течение 1 ч, Гель интенсивно проивают карбонатным буфером,водой и наконец диоксаном, К раствору 1,2 г октипянтарной кислоты.в 40 мл диоксана добавляют раствор1, 84 г дициклогексипкарбодиимидав 10 мп диоксана и 25 мл сефароза-цистеамина через 2 ч при.перемешиванни при комнатной температуре, Через2 ч гель: промывают диоксаном. Реакционнуа методику повторяют и затемтщательно промывают диоксаном,смесью диоксана и воды, водой и 0,1 И.Карбоната при рН 8,5, Оставшиесятиольные группы блокируют в результате обработки геля,бО мг иодоацетамида в течение 45 мин.Наконец,гель.Пром 1 вают испытательным бубером.Лспытание на Ац-анти ген.Антиген-положительную плазму ститром 1:32 исполЬзуют в качествеисходного материала, Адсорбцию,осуществляют периодически согласнопримеру 3, Верхний слой испытываютна антиген и он дает.отрицате 11 ьнуюреакциюзП р и м е р - 12. Удаление А 1-аитигена нз плазмы адсорбцией на .конъюгат сефароэа-(1 ексаметилендиаминнафтил-уксусная кислота)Систему сефароэа-гексаметилендиамин получают согласно примеру 1. 25.мп полученного вспомогатепьнлго геля переносят на стеклянно фильтр и промывают смесью пйИС 4 вйз и ФМь (3:2) перед сушкей ПОЮ МЗ)ЗЕЮФИНФИ710504 Формула изобретения Составитель С.МалютинаРедактор Н.Потапова Техред М.Келемеш Корректор И,Муска Заказ 8785/53 Тираж 673 ПодписноеЦНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035 Москва ЖРа ская наб, д.4/5 Филиал ППП Патент, г.ужгород, ул.Проектная,4 и переносом в свежий раствор 1,1 гнафтилуксусной кислоты, в 30 мл смеси диоксана и воды (3:2) . К гелевойсуспензии добавляют 2,65 г воднорастворимого карбодиимида, М-циклогексил-М(й-метилморфолинэтилЦ - 5-карбодиимид-и-толуилсульфонат прнперемешивании и затем устанавливаютрН 4,8 с помощью разбавленной хлористоводородной кислоты. Через 1 чстояния при комнатной температуре2,65 г водорастворимого карбодиимида добавляют во второй разСмесьоставляют стоять еще на 1 ч при перемешивании .перед переносом на стеклянный фильтр и тщательно промываютдиоксаном, смесью диоксана и воды(3;2), 1 М раствором хлористогонатрия, водой и испытательным буфером.Выход реакции сочетания в расчетена используемую нафтил-уксуснуюкислоту по методу ЯМР составляет 3,0,20Испытание на Ац-антиген.В качестве исходного вещества используют антиген-положительную плазмус титрами 1:32 и 1:64. Адсорбциюпроводят периодически согласно 25примеру 3. Верхний слой испытываютна АО -антиген, и он дает отрицательную реакцию,П р и м е р 13, Удаление АО-антигена из плазмы адсорбцией на конъюгат сефароэа(гексаметилендиаминхолестерин кислый сукцинат).Получение гель-производного.Систему сефароза-гексаметилендиамин получают согласно примеру 1, 3520 мл полученного в результатепромежуточного геля переносят настеклянный Фильтр и промывают диоксаном, 10-ным раствором триэтиламина в диоксане и снова диоксаном,перед сушкой на фильтре под разрежением и переносом в свежий раствор0,5 г кислого сукцината холестеринав 25 мл диоксана. Реакцию начинаютв результате добавления 0,35 г дициклогексилкарбодиимида, растворенного в 1 мл диоксана. Сочетаниеосуществляют при перемешиваниипри комнатной температуре, Через2 ч добавляют дополнительное количество карбодиимида и 2 ч спустя 50гель промывают диоксаном, смесьюдиоксана и воды, водой и испытательным буФером.Испытание на АО -антиген,Антиген-положительную плазму с утитрами 1;64 и 1:128 используютвкачестве исходного вещества. Адсорбцию осуществляют периодически согласно примеру 3. Верхний слой испытывают на антиген и он дает отрицательную реакцию.П р и м е р 14, удаление АО-антигена из плазмы адсорбцией на конъюгат сефароза- (гексаметилендиамин-холевая кислота).Получение гель-производного,Систему сефароза-гексаметилен диамин получают согласно примеру 1.Сочетание холевой кислоты с полученным промежуточным гелем осуществляют согласно примеру 13, за исключениемтого, что 0,5 г холевой кислоты растворяют в 100 мл диоксана.Выход реакции сочетания в расчетена холевую кислоту определяют методомЯМР, и он составляет 5,8.Испытание на АО -антиген.В качестве исходного материала используют Ац -антиген-положительнуюплазму с титром 1:32, Адсорбцию проводят периодически согласно примеру3. Верхний слой испытывают на антиген и он дает отрицательную реакцию,Предлагаемюй способ обеспечиваетвысокую степень очистки биологического материала и упрощает технологиюочистки,. Способ очистки биологического материала от вируса гепатита В путем сорбции исходного материала, преимущественно крови, на сорбент,о т л ич а ю щ и й с я тем,что,с целью повышения степени очистки и упрощения способа, в качестве сорбента используют водонерастворимую матрицу, ковалентно связанную посредством таких групп, как- О - С - ЪН -- О - С - БН - 24 Н -1) ПХН ХН0и-ВН- (СН ) - Хн- - С-ХН- иц - ЗН-Со -гг-ьс гидрофобным лигандом,2, Способ по п,1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве водонерастворимой матрицы используютсефароэу 4 В.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Д,В 1 о 1 есйп 1 с, ВХоепд 1 пеег,16.1974, р.593.

Смотреть

Заявка

2380201, 08.07.1976

ЛАРС-ОЛОВ АНДЕРССОН, ХОКАН ГУННАР БОРГ, ГУДРУН МОНИКА ЭЙНАРССОН

МПК / Метки

МПК: A61K 47/00

Метки: биологического

Опубликовано: 15.01.1980

Код ссылки

<a href="https://patents.su/5-710504-sposob-ochistki-biologicheskogo-materiala.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ очистки биологического материала</a>

Похожие патенты