Способ получения мукополисахаридов

О П И С А Н И Е, 961565ИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик АТЕЯпубликован юллетен ата опубликования описания 25 .09.8 Иностр тору Е Сабур (Япон нцыомотоТикУеноя)) Авторыизобретени Охара Тецуя Хотт сикуми Иностранная фирмаагаку Когио Кабуси"Куре аис Б 4) СПОСО ЧЕНИЯ МУКОПОЛИСАХАРИДО тение относится к мукополисахаридо воопухолевой акти яющих интерес с т ьзования их в мед Изобр получения щих проти представл ния испол способам , облада ностью и чки зре-. цине мукополи етов, х из бов, й Сог- ог 1 о 1 цз:заклносу что пол экс явых а- .ных с последуюбчисткой нсушкой,ах ени оше егз ю л Известен способ получениясахаридов из грибов базидиомипредусматривающий экстракциюмицелия и/или плодовых тел грвыбранных из группы, включающоцз чегз 1 со 1 ог (Гг.) Оце.,Ь 1 гзцйцз (Гг.) Оце 1 Сог 1 о 1 цдащепцз (Гг,) Рат,. водой иливодным раствором щелочи при 6отделение экстракта, его концрование, высаливание сульфатония, перерастворение осадка ищей хроматографичеса ионообменных смол Полученные в результате выд вещества представляют собой по риды, связанные с белками, соо ние полисахаридной и белковой частей ю- "находится в определенном интервале.Эти вещества показывают значительноепротивоопухолевое или противораковое5 действие при внутрибрюшинном введении Г 11.Однако известные вещества оказывают очень слабое противоопухолевоедействие при стоматическом введении.1 О Пбэтому, хотя известные вещества могут представлять большой интерес длянаучйых исследованийкая полезность огран Целью изобретения является улучие свойств получаемого продукта, ючающееся в обеспечении возможтей более успешного применения. казанная. цель достигается тем, согласно способу получения муко исахаридов, предусматривающему тракцию их из мицелия и/или плодо тел грибов базидиомицетов, выбра из группы, включающей Сог 1 о 1 цз 1 со 1 ог (Гг.) Ъе 1.; Согюо 1 цз Ь 1961565 19 20 1 Продолжение табл 2 с Результатыавваватт Цветная реакция Цвет таею Реакция с триптофаноми серной кислотой Пурпурно-, коричневый Способ Лоури"фолина Голубой саАминокислоты Реакция с нингидрйдомпосле гидролиза соляной кислотой ( 6 н. НС 1,110 С, 20 ч фиолетово"голубой Таблица 3 Ге Содержание. влаги, Ф, через,ч Условия 9820 С 12,5 16,0 22,5 25,5 27,0 27,0 27,0 10,0 9 ьО 9 ю 5 11 р 7 15,0 15,5 16,016,617,0 79325 еС 5220 ф С 9,0 9,5 1 1 7 15 0 15 3 15,5 1 5,7 16, О 8,5 9,0 10,0 12,5 12,5 12,5 12,5 3216,44 С 8,0 е цруттт т Таблица 4 е ю т Продукты гидролиза метилированных" сахаридов Связь Иолярное соотноеение в е а е еее е е вава е а 2 3,4,6 тТетратОме-, .: тилС . 62,3,6 ГТри"0-метилС 2,3 ДитОтметилС2,6 ДиОтметилС 2,4 тДитОметилС 0 53 2,4,6 тТри 0 метилСв ю Относительная влажностьТемпература Относительная влажностьТемпература Относительная влажностьТемпература Относительная влажностьТемпературае Пептидныесвязи, тиро"зин, триптофан, цистеин 13 т 12 0,12 52 или менее2 или менее21 96165 22 таблица 5 е е е ее е е е ее е Вид жиВОтнОГО аЭ МГ/КГ Путь введения Самки Самцы 71300 Ъ 5000 15000 Мыши Стоматически 72000020000 Внутривенно 7600". 600 5000 5000 Крысы500020000 5000) 20000 Таблица 6 Коэафициентподавленияопухоли, Ф веее гг г Способ пересадки и вве"денная Раса еаи или крысы Число леток, пересаженныхживотному Доза, мг/.в день хкратностьвведения1010 24 10,х 11 32 24. 50 х 10 35 97-100 100 7 дн. 250 л 10 60 Оапгщ 1. 1 Р - 1 Р 10 Асцнтическаятепатоме АйБолее 70животныхылечи вает"ся и выживает в ввэв г вггеввеге г г еЛ р и м е ч а н и е, ЗС подовне;.1 Р . енутрибрюаинно; РО - анутрибриаинно н стоматическиФ г геевв веге вегеееввРаяювое ноеообравоеаниеЭрлиха 1 тверв.дай тип 1 Внутривенно 11300 Подкожно 75000 Внутрибрющинно Ъ 5000 ПодкожноВнутрибрвшинноСтоматицески Время до начала введенияпосле пересадки,ч Время,необходимоедля овенн действия,дни посвле пересадки 9710097-100859024Таблица 7 Пример Покдэатели ее ее Е е ее е1 2е е еееееЕе е еЗс 2412, 2412 2413 2414 СИ 101 СИГорячаявода Горячаявода Выход, г, на 100 г су" ОДхих грибов 0,9 Молекулярный вес ( х 10 ) 0,8-25 1)0-19 0,8-294,7 8,9 0,5-28 Средний молекулярныйвес ( х 104) 6,8 9,0 Пурпурный Пурпурный Пурпурный Пурпурный Реакция с с,"нафтоломи серной кислотой Коричневый Коричневый Коричне- Коричневыйвый Реакция с индолои и серной кислотой,Зеленовато"голубой Зеленоватоголубой Реакция с антрономи серной кислотой Зеленова- Зеленовато.тоеголу" голубойбой Коричневый Реакция с фенолом и серной кислотой Коричневый Коричневый Коричневый Реакция с триптофаном Пурпурно" Пурпурно- и серной кислотой , коричневый коричневый Пурпурно- Пурпурно" коричнее коричневый вый Способ Лоури-фолина Голубой Голубой Голубой Голубой фиолетово-фиолетовоголубой голубой фиолетово- фиолетово"гойубой голубой 0 3600-3200 Присутст" Присутст" Присутст- Присутст"вует вует вует вует 11 11 11 1600 ГЕРМ-Р, й 1Линия, ЮСпособ экстрагирования Цветная реакция (сахарид) Цветная реакция (белок) Реакция с нингидриномпосле гидролиза .с соляной кислотой (6 н.НС 1, 20 ч) И Удельное вращением 1 Ф ИК-спектры поглощения,смст- Отсутст" Отсутст вует вует 4 7+О т- Отсу вует541 Присутст- Присутст- Присутст- Присутст.вует вует вует вует 861 79,8Область поглощения,Меде оотношение интенсивости поглацения Глюкозидный анализ типсвязи) Отсу вует 09 0,3 Присутвует Присутствует 8,0 2,0 Присутст"вует Присутствует27 961565 Показатели При.мер ее в е еа эЩ фь 16 ф1,8 7,1 3,8 7,4 1,5 7,8 Пролин Глицин АланииЦистеинВалин 8,9 8,5 7,8 9,5 7,6 7,6 7 4 7 5 1,7 Иетионин 4,6 4 7 4,7 8,0 7,1 8,0 2,0 1,8 2,2 5,0 5,2 5 0 09 2,4 2,4 2,8 2,8 1,7 29 3,4 2,8 2,8 3,2 2,9 74,7,75,6 73,7 75,1 Составляющий моносахаридГлюкоза Часть, ФАминокислотный анализ Аспарагиновая кислота 18,4 Глутаминовая кислота 12,3 ИзолейцинЛейцинТирозинФенилаланинТриптофанЛизинГистидинАргинин1 Аммиак) Общее количество ас,парагиновой кислоты,азатели ример ъйе100 05 Ингибирующее действиеи ч 11 го на рост клетокасцита Эрлита ( ЕС"клеток)мышейПоглощение Н"уридинаРНК ЕСклеток через120 мин 1 контрольноепринято за 100) О г/мл 72 65 71 64 65 60 00 б 6 60 9 00 6 2 2000 Подавление роста клетасцита ЭрлихаЦг/мл 30 ркомамы г/кг 10 9 99 8 10 100 100 0 00 84 500901000 8 9, Противоопухолевая активность 1 п ч 1 йго на ингибирование роста кле ток асцитической гепатоми АН, 1 Со аг/мл 2000зПоглощение Н "тимидинаДНК ЕС-клеток через120 мин 1 контрольноепринято за 100),р г/мл Противоопухолевая актив-.ность п чиччо (ингибирование роста) Все выжи- Все выживают Все выжи- Все выживавают вают961565 33. 34Продолжение табл. 7 Показатели Пример ва"мг/кг Раковое новообра ние Эрлиха мышей 100 100/10 8/10 7/10 фР 250 Табли Сог 1 о 1 из Ь 1 гзойцз Сог 1 о 1 цз рагдаае(Гг.) 0 це 1 поз (Гг.) Рай 71 2711 тамм ГЕРИ-Р, Й орячей Горячей водой и кта на 100 г сухи грибков,Выход пр олсульфркислотой урпурная акция Реакци ндолсульфокисло ори чневая Зеленоватоголубая отой Зеленоватоголубая с антронсул еа Коричневая Коричнев Пурпурно-коричневая урпурно-кори чевая ГолубаяПурпурно"голуба лубэ Пурпурно-голуб сле гидрой в течеАНкрыс (выжившие)//число использованныхкрыс, через 60 днеймг/кг Метод экстракционной обработ олекулярныи весредний молекулярный весветные реакции сахарида еакция с фенолсульфокислотойеакция с триптофансульфокислотой Цветные реакции бел По методике Лоури-фолин Реакция с нингидрином полиза 6 н. соляной кислотние 20 ч 0,6;29 х 17,9 х 104 Пурпурная Коричнева 0,6 - 30 х 1 О8,3 х 10ф36 96565 т аетв та тт та а Р еа а ее Вид Сого 1 цз Ы гзцсць.2,ОЙДО,1 1 Отсутствует Отсутствует Имеется Имеется 79,8 82,5 для полисахарида 20,2 для белка 1,7 4 6 4.40,9 1,0 017 0,6 25Удельное вращение Ы 3 Спектрограмма поглощения инфракрасныхлучей, смЗона поглощения, ррщ 4,510, 4,740,1 5,00,1 5 4+0,4Коэффициент интенсивности поглощения Гликозидный анализ тип соединительнойсвязи) Продолжение табл. 8 а т ттСогоцв рагдапепцз(Гг.) Рае. Имеется полоса Имеется полоса 11Отсутствие полос Отсутствие полос(Гг.) цце 1 Вид ю еее в е ие 0,8 0,8 Глюкоза Глюкоза 17,8 17,4 7,2 6,7 10,1 14,6 0,7 0,8 глицин 8,6 8,6 8,4 8,1 алании Следы Следы цистеин 6,5 6,7 валин 1 3 метионин и золейцин 79 6,7 лейцин 0,3 0,4 тирозинфенилаланин 4,1ФСледы . триптоФанлизин Следы 3,7 3,2 0,8 1,0 3,0 2,9 2,5 71,9 Состав моносахарида Содержание, ФРезультаты аминокислотного анализа аспарагиновая кислотатреонинсерииглутаминовая кислотапролин гистидинаргинин( аммиак ) Общее содержание аспаргиновой кис" лоты, глутаминовой кислоты, глицина, аланина, валина и лейцина 38Продолжение табл. 8 Сог 1 о 1 цз рагдаеепцз5 фо 1 ц 5 рагпащепцэ (Гг.) Рай. - штамм ГЕРИ-Р И 2712.Однако для промышленного производства наиболее выгодно использовать Сог 1 о 1 цэ чегэ 1 со 1 ог (Гг.) Оце штамм ГЕРИ"Р Ю 2412, так как он может обеспечить самый высокий выход предлагаемого вещества. В качестве исходного материала можно применять как Сого 1 цэ чегэ 1 со- эф 1 ог .(Гг.). Оце - штамм ГЕРИ-Р У 2412- 2426, так и Сог 1 о 1 цэ Ьгэцйцэ (Гг.) Оце 1 " штамм ГЕРИ-Р й 2711, и Сог 1" 3 96156 вццэ (Гг., Оце 1., Сог 1 о 1 цэ рагдавепцэ (Гг.) Рай., с помощью воды или 0,01-0,5 н, водного щелочного раствора при 95-100 С, отделение экстракта, его концентрирование, Фракционированное осаждение целевого продукта сульфатом аммония, диалиэ и хроматографическую очистку диалиэата, иэ вида Сог 1 о 1 цэ чегэ 1 со 1 ог (Гг.) Оце используют штаммы РЕВИ-Р У 2412"2426,. 1 О из вида Сог 1 о 1 цэ Ь 1 гэцйцэ (Гг.) це штамм ГЕЙМ-Р йф 2711, иэ вида Сог 1 о цэ рагяащепцэ (Гг.) Рай. " штамм ГЕВИ-Р Р 2712, иэ сконцентрированного экстракта удаляют низкомолекулярные и вещества путем добавления сульфата аммония в количестве, соответствующем 100 степени насыщения, с последу.- ющим перерастворением полученного осадка в воде и диализом., фракциони рованное осаждение сульфатом аммония осуществляют сначала в количестве 2512 .от насыщения с удалением полу" ценного осадка, затем в количестве 404 от насыщения с последующим диапи" и эом, а хроматографическую очистку диализата осуществляют на диэтиламиноэтилцеллюлозе с элюацией 1 н. раствором МаС 1, после чего целевой продукт выделяют осаждением сульФатом зв аммония в количестве 403 от насыщения с последующим диализом и сушкой. распылением.Используемые штаммы депонированы в Научно-исследовательском институте ферментации ( Агентство промышленных исследований и технологии) в Японии.На фиг. 1 графически изображен инфракрасный спектр поглощения предлагаемых веществ " полисахаридов, связанных с белками; на Фиг, 2-6 - спектры протонного магнитного резонанса пред" лагаемых веществ.Иукополисахариды, полученные предлагаемым способом, более эффективны при подавлении образований из переса" женных опухолевых клеток. на подопыт" ных животных по сравнению с продуктом, полученным в соответствии с известным способом, при стоматическом при-" .менении.Результаты сравнения противоопухолевых активностей приведены в табл.1Способ осуществляют следующим образом.Грибы-продуценты предварительно выращивают и мицелиальную пленку, выросшую на поверхности питательной среды, гомогенизируют физиологическим раствором, чтобы получить посевной материал для производства культу ры. Посевной материал подвергают ста ционарному выращиванию или выращиванию погружением для развития. грибницы, которую экстрагируют, применяя водный растворитель " горячую водуили. разбавленный щелочной раствор.Полученный экстракт после, удаления иэ него остатка от экстракции концентрируют и затем подвергают высаливанию сульфатом аммония или ультра- фильтрации для удаления низкомолекупярных веществ. Очищенный таким обра" зом экстракт концентрируют до 5-10 по весу. В этот концентрированный раствор затем добавляют сульфат аммония в количестве соответствующем 253 от величины насыщения, с целью проведения фракционированного осаждения, и удаляют образовавшийся осадок, В полученный раствор снова добавляют сульфат аммония в количестве, соответствующем 40 величины насыщения, и полученный .осадок собирают. Собранный осадок растворяют в воде и обессоливают с помощью диализа. Образовавшийся раствор пропускают через кколонку с ДЭАЭ-целлюлозой и вещество, адсорбированное на колонке, промывают водой и затем вымывают 1 н. солевым раствором. В полученный элюат снова добавляют сульфат аммония в количестве, соответствующем 403 величины насыщения, для получения осадка. Полученный осадок снова растворяют в воде и затем обессоливают с помощью диализа, Полученный очищенный продукт высушивают.Характерные свойства предлагаемого вещества.Цветные реакции.Испытания на цветные реакции проводят с водными растворами предлага961565 ааааа еа аеа ее е Вид СогФо 1 цз 1 гзФоз(Гг.) е 1 е еаее а е е аа е а астрая токсичность аЭвдля ьеаей 1 мг/кг ъ 1300 1300 5000 1 5000 5000 Ъ 50005000 1500050005000 самцы сбмки Острая токсичность ЫЪ для крыс, мг/кг 1600600 600 600 50005000 самцы,25000 15000 5000 5000 самцы 5000 5000 самцы самки при внутривенном введении самцы самки при подкожном введении самцы самки При внутрибрюшинном введении самцы самки При введении через рот При внутривенном введении: самцы самки При подкожном введении самкиПри внутрибрющинном введении: самкиПри введении через рот Противоопухолевая активность 11300М 300. ф 20000 20000 Ъ 20000 ъ 20000 40Продолжение табл. 8 фСого 1 цз рагдаеепце(Гг ) 0 це 1 Вид 99 100 Способность подавлять рост асцитныхклеток Эрлиха ( клетки ЕС ) в организ"ме мышей в лабораторных условиях: По истечениии 120-минутного поглощения Н-уридина РНК клеток ЕСза контрольный результат взято 100)мкг/йВ 500 1000 63 60 2000 По истечении 120"минутного поглощенияН-тимидина ДНК клеток ЕС ( за контрольный результат взято 100, мкг/мп 500 60 1000 60 50 2000 Подавление роста асцитных клеток Эрлиха 3000 мкг/мл 98 250 100 100 100 100 500 89 88 1000 Подавление роста асцитной гепатомыв лабораторных условиях, клеткиАН, 1 СО мкг/мл Противоопухолевая активность в ла"бораторных условиях (подавление роста) Мышиная саркома"1801Внутрибрюаинное введение,мг/кг Введение через рот,мг/кг500 Полная выаивае ьПолная выживае"мость мость(Гг,) Оце 1ае Е в а а а Вид Внутрибрюшинное введение, мг/кг 50 100 100 Крыса АН 13 (выживаемость. число ис"пользованных для опыта животных по ис"течении 60 дней )Внутрибрюшинное введение, мг/кг 8/10 8/10 290 ракта удаляют низкомолекулярные ве-. щества путем добавления сульцата аммония в количестве, соответствующем 100 степени насыщения, с последующим перерастворением полученногоосадка в воде и диализом, цракционированное осаждение сульФатом аммония осуь 3 ествляют сначала в количестве 25 Й 23 от насыщения с удалением долу 3 енного осадка, затем в количестве 403 от насыщения с последующим диализом, а хроматограцическую очистку диализата осуществляют на диэтиламиноэтилцеллюлозе с элюцией 1 н. растворомИаС 1, после чего целевой продукт выдЬ ляют осаждением сульфатом аммония в количестве 40 от насыщения с последу. ющим диапизом и суакой распылением. формула изобретения Источники информации,лринятые во внимание при экспертизе Патент Великобритании й 1331513 опублик. 1973.Мышиная болезнь Эрлиха Способ получения мукополисахаридов, предусматривающийэкстракцию их из мицелия и/или плодовых тел грибов ба- зидиомицетов, выбранных из группы, включающей Сог 1 о 3 ы чегз 1 со 1 ог (Гг.) С 3 це 3., Сог 1 о 3 цв Ь 1 гзцйцз (Гг,) Юце Сог 1 оЗцв рагяапепцз (Гг.)"Рай., с по" мощью воды или 0,01-0,5 н. водного Зв щелочного раствора при 95-100 фС, отделение экстракта, его концентрйрование, цранционированное осаждение це" левого продукта сулъфатом"аммония, диализ и хроматографическую очистку диа ф лизата, о т л и ч а ю щ и й с я теи что, с целью улучшения свойств полу-: чаемого продукта, из вида Сог 1 о 1 цз чегзсо 3 ог (Гг.) Оце 3 используют атаймы ГЕВИ-Р йф 24122426,из вида Сог 1. в о 3 цз Ь 1 гзцьа-(Гг.) Яце 3 - штамм РЕЯМ-Р й 2711, из вида Сог 1 о 1 цз раг" ,9 аеепцз (Гг.) Рай. - штамм ГЕВМ"Р У 2712, из сконцентрированного экствв веевветааа еета961565 Скородец енк комитета и открыт ская наб по Филиал ППт аврод, ул. оектная,Редактор Л. ЛчкаВ ЪФ ФЕЮ 5 Юф ЕЕФ шЗаказ 733/78ВНИИП Г 9 3 Составитель Техоед А.Баб Тираж 505 Государственног делам изобретени Москва ,ЖРаА й Л "Патент", г. Уж ваКорректор А, ГПодписноеСССРйьВ Ч/5,представленные в табл. 2. Из приведенных результатов испытаний на цветные реакции очевидно, что предлагаемое вещество содержит сахариды и белок. 3Растворимость.Получаемые вещества растворяются,а воде и почти не растворяются в ме,таноле, пиридине, хлороформе, бензоле и гексане.Гигроскопичность,Для определения гигроскопичностипредлагаемого вещества несколько образцов помещают в эксикаторы, в каждом из которых поддерживается эадан 1ная относительная влажность 1,табл,3)с помощью насыщенных растворов солейи содержание влаги в каждом образцеопределяют, измеряя изменение весасо временем.Изменение поглощения влаги со .временем при каждой относительнойвлажности представлено в табл, 3,Применяемым насыщенным растворомдля 32 относительной влаиности служит насыщенный раствор хлористого натрия и азотнокислого калия; для 523относительной влажности " насыщенный.раствор двухромовокислого натрия; для793 относительной влажно:ти - насышенззный раствор хлористого аммония; для98 относительной влажности - насыщен-;ный раствор аэотнокислого свинца. 65 6ток в бромистом калии, показан на фиг, 1, Широкую полосу поглощения при 3600/3200 см относят к М ОН- групп, которые в различной степени вступают в водородную связь. Это можно объяснить тем, что широкая полоса поглощения ослабляется или исчезает, когда гидроксильные группы в полисахаридной части образца метоксилиЬуют. Поглощения при 1600 и 1530 см-" при-, писывают деформационным колебаниям -йН и -ИН соответственно, Предполо" жительно такое явление возникает отбелковой части образца. С другой сто роны, широкие полосы поглощения при 1200-1000 см рассматривают, как вы,званные несимметричным валентнымко" ,лебанием связи С-О-С в пиранозных кольцах в полисахаридной части. Кроме того, при 890 см-" наблюдают харак- терный тип поглсщения, возникающий от -связи глюкозы в полисахаридной части, но характеристическое поглоще" ние при 840 см , возникающее от с-свя", Ьи, различают с трудом. Структура полисахаридной части. Для определения структурных характеристик полисахаридной,части предла" гаемого вещества к образцу весом10 мг добавляют 33-ный раствор соляной кислоты в метаноле, чтобы выполнить метанолиэ при 100 фС в течение 16 ч, и затем, после введения три Как видно из табл. 3, каждый образец предлагаемого вещества претерпе"вает незначительное изменение внешнего вида и расплывания, вызываемогопоглощением влаги, не наблюдается.Величина рН,,40рН предлагаемого вещества измеряется при растворении образца весом1 г в 100 мл воды. Найдено, что оноимеет рН 6,6-7,2. Это указывает нато, что предлагаемое вещество, по су"ществу, нейтрально,Оптическое вращение,Оптическое вращение предлагаемого вещества измеряют, применяя0,253-ный водный раствор образца, .чтобы определить удельное вращениес.Оно находится в области от 0до 30 и предполагается, что предлагаемое вещество состоит преимущественноиз-глюкана, удельное вращение которого порядка О.ИК-спектр поглощения.ИК-спектр поглощения предлагаемо"го вещества, измеренный методом таблеметилсилильных групп обычным способом,подвергают гаэохроматографическомуанализу, Результаты показывают, чтоглюкоза составляет более 99 ь общегоколичества сахаридов, а другие сахаридные компоненты, такие,как ыанноза, галактоза, ксилоэа и фруктоза,;пред-ставлены очень скудно. Для того, чтобы установить тип. глюкозы (О" или-тип), кристаллы глюкозы отделяютот продуктов гидролиза предлагаемоговещества. Найдено, что точка плавле"ния отделенной глюкозы находится вобласти от 143 до 145 С, и когда крис"таллы глюкозы смешивьют со стандартной О-глюкозой, не наблюдается сниже" .ния точки плавления, Поэтому глюкозу,составляющую полисахаридную частьпредлагаемого вещества, идентифицируют как О-глюкозу.Характеристики вида связи сахаридов, составляющих полисахариднуючасть,Положение глюксэидной связи определяют следующим образом.. подтверждают из анализа моносах ридов, полученных по методу.окис- з ления.периодатом или разложением по способу Смита, и их соотноаение в со-. ставе определяют в опытах по метили,рованию по способу Хеуорса. В процес" се идентификации сахариды, полуцен" 10 ные при гидролизе метилированных со" единений, идентифицируют с помощью газовой хроматографии как альдитолацетат и метилглюкозид. Индивидуальные продукты, гидролиза выделяют жид"13 костной хроматографией на .колонке и. затем кристаллиэуют или переводят в их кристаллические производные.для подтверждения . Иолярные соотноаения каждой связи в предлагаемом вещест" ве даны в табл. 4, причем молярное содержание С - -связи принято за 1. Иолярные соотнощения, приведенные .в табл. 4, определяют по площадям пи" ков на газовой хроматограмме:альди" толацетата.Как видно из табл. 4, считается, цто полисахаридная часть предлагаемого вещества состоит, главным образом,з= 1,4-связей, но в этой полиса-Эфаридной части существуют также и -Т,З"связи и многие ответвления. Наосновании этого можно сказать, цто полисахаридная часть предлагаемого вещества представляет собой структу- .ЗЗ ру, в которой боковые цепи связаны с главными цепями целлюлозы и сущест вуют отдельные Р,3-связи.Характеристики белковой части.Белковую часть предлагаемого ве- " фв щества гидролизуют обычным способом и аминокислоты, составляющие продукты гидролиза, анализируют с помощью анализатора аминокислот.45Содержание аминокислот, составля" ющих белковую часть, вес.Ф:апарагиновая кивяЬвтаТреонинСерииГлутаминовая кислотаПролинГлицинАланинЦистеин. ВалинМетионинИзолейцин Лейцин 6-8 Тирозин Следы - 3 Фенилаланин 3-6 Триптофан Следы - 2 Лизин 2 "4,.Гистидин Следы - 2 Аргинин 2-4 Аммиак 2-6 Следовательно, белковая часть предлагаемого вещества содержит 18 видов аминокислот, среди которых преобладают кислые и нейтральные аминокислоты, а количество основных аминокислот оцень ограничено. Для предлагаемого вещества также характерно, что аспарагиновая кислота, треонин, серин, глу" таминовая кислота, глицин, аланин, валин и лейцйн вместе составляют более 703 всех аминокислот, найденных в белковой части.Хотя присутствие глюкозамина также подтверждается при аминокислотном анализе, количество этого веществасоставляет менее 1 по весу от общегоколичества белка Что касается связи этих аминокислот с полисахаридной частью, предполагается, что аминокислоты прочно связаны с полисахаридной частью в виде олигопептида или пептида. Это предложение можно вести иэ результатов различного рода испытаний.При испытаниях по методу Севага, который часто применяют для удаления из образцаЪримеси белка, образцы предлагаемого вещества осадка не образуют. Для практического осуществлеьщя этого метода добавляют 1/5 объемахлороформа и 1/25 объема й -бутанола к водному раствору каждого образца (желательно поддерживать величину рН раствора от 4 до 5) и затем энергично встряхивают смесь. Раствор вниматель" но рассматривают, чтобы определить образуется ли какой-нибудь гелеобраэ- ный осадок или нет. Если полисахаридйай- часть и белок существуют в образце в виде простой смеси, белок денатурируется, образует гель и оседает между слоем воды и слоем хлороформа, но такого осаждения не происходит в том случае, когда полисахарид и балок связаны.Еще в одном опыте по осаждению, который проводится подобным образом с применением трифтортрихлорэтана,снова не наблюдается образования осадков из образцов предлагаемого вещества.Кроме того, образцы предлагаемого та гриба, принадлежащего к Сог 1 о 1 оввещества не показывают изменения со" чегосо 1 ог (Гг.) Юие 1, после фильтра-держания белка в опыте, в котором на ции экстракта под давлением, горяобразцы предлагаемого вещества воз- чей стерилизации и высушивания распыдействуют протеазой " протолитическим ф лением (такой продукт обозначаетсяэнзимам, как Р 5-К). Наибольшим различием межау1 ъНа основании результатов предыду- Р 5 -К - предлагаемым веществом, какщих испытаний предполагается, чтоиз Фиг. 2-6, является то, что в слу"в предлагаемом веществе полисахарид- . чае предлагаемого вещества абсолютноная и белковая части не просто смеша- не наблюдается поглощения в областиюоны одна с другой, а химически связаны 4,9-6,0 м.д., возникающего из-задруг с другом 4-связей. Этот факт подтверждает,Что касается типа связи полисаха- чтополисахариднаяцасть предлагаемогоридной и белковой частей в предлага- вещества состоит из одного 8-0-глюкана.Иемом веществе, то известны следующиеПоглощение при 4,5 м.д. (Фиг. 2)типы связи сахара и белка: М-ацил- :.относится к".(1-ф 4) и Р (1гликоэиламинный, О-глюкоэидный и глю- в протонах метина в 1-ом положении,козидэфирный, но в случае предлагае" в то время, как поглощение примого вещества, всвете тех фактов, . 4,7 и;д. связывается с р -( 1 - ф 31что свЯзи могУт с тРУдом РазРУшатьсЯ и( 1 -+ 2 ) в пРотонах метина вслабой щелочью и что после гидролиза1-ом положении. Поэтому можно опредепредлагаемого вещества при анализе лить соотношение р (1 -4) иаминокислот отмечают присутствие глю- р (1 - 6) / р (1 - у 3). и 3 "коэамина, считается, что в предлагае т 2) но так как включается251мом веществе преобладает М-ацилглюко- также разветвленное строение, упомяэиламинный тип связи. нутый метод метилирования должен быть- Протонные спектры ядерного магнит- использован ля разъяснения тонкойного резонанса ЯИР .структуры.ЯИР ( 100 ИГц ) предлагаемого вещест- цто касается белковой части, едвава измеряют, применяя в качестве раст ли, можно считать доказанным строение30ворителя тяжелую воду и выбирая в ка- такой белковой части только на осночестве стандарта 2,2-диметил-силано- ванин измерений спектров ядерного маг". пентан"сульфонат натрия ( ДСС). Ре.- нитного резонанса. Однако, так какэультаты приведены на.фиг. 2-6. Если предлагаемое вещество показывает по" .предполагается, что поглощение от 0,53 лощение в некоторых, упомянутых ниже,до 2,5 миллионных долей ( м.д.) по заданных областях, этот метод сцита"ДСС связано с протонами боковых це" .ется оцень подходящим Для идентифика-.пей белковой части, а поглощение от ции предлагаемого вещества2,5 до 6,0 м.д- с протонами поли- . Предлагаемое вещество показывает. сахаридной части, и если свойства фв . поглощение при 0,90,1; 1,2 0 ф 1предлагаемого вещества, в соответствии 2 О+0,1; 4,5+0,1 и 4,710,1 м,д., нес приведенными определениями, вы- , поглощает в области 4;.9-6,0 м.д. иражаются посредством соотношения ин- дает широкую полосу поглощения в обтенсивности сигналов протонов Двух ласти 3,0-.4,4 м дчастей, то такое соотношение находит. фэ . Иолекулярный вес.ся в области от 95/5 до 55/45 При Иолекулярный вес предлагаемогоупомянутых измерениях ЯИР для Устра вещества, измеренный методом ультранения влияния, остаточной легкой водытрифугирования, гаходится в обласв тЯжелой воде польэУютсЯ величина- ти 5000-З 00000 и сРедний молекУлЯР"ми после коррекции в соответствии с Ю ный вес находится в области 10000 допущением кривой Лоренца.100000, Величины, полученные при дру-.гих способах определения, таких какОтносительно поглощения полисахариднои части пик поглоще ипопа ают в область2,5-4,1 м.д, возникает благодаря про- рации, также попадают в о ластьтонам метиленовой группы в - и -по-,2- 6-по-, ф :10000- 100000. Поэтому можно предпололожениях в пиранозных кольцах цепи жить,жить что с едний молекулярный веср дсахара. Для сравнения может быть пред- предлагаемого вещества лежит в облас-ложен продукт, полученный из экстрак- ,ти 10клетками асцита Эрлиха мышей (ЕС-клетки), ЕС-клетки (5 х 10/мл) выращиваютв питательной среде Еап 1 е МЕМ, содержащей 500, 1000 и 2000 о г/мл предлагаемого вещества и 0,5 С/мл Н-уридина или Н-тимидина, при 37 С в течеЭние 120.мин. Для контроля вместопредлагаемого вещества добавляют стерильный физиологический раствор. Предлагаемое вещество может уменьшить поглощение Н-уридина РНК ЕС-клеток доЭ704 от контрольного при содержаниипредлагаемого вещества 500,0 г/мл,через 120 мин, до 653 от контрольного при 1000,аг/мл и до 60 от контрольного при 2000,0 г/мл. Предлагаемоевещество может также уменьшить поглощение Н-тимидина ДНК ЕС-клетокЭдо 653 при 500.,ог/мл, до 603 при1000,д г/мл и до 2000 юг/мл, через120 минут, соответственно,Испытание противоопухолевой активности 1 п ч 1 чо и 1 п ч 1 йго. (Подавляющая активность предлагаемого веществапротив роста клеток асцита Эрлиха).Исследуется против роста клеток асцита Эрлиха мышей. ЕС-клетки (5 х 10 ф клеток/мл) инкубируют в растворе Ханка,содержащем 5000,ог/мп предлагаемоговещества, при 37 ОС в течение 3 ч.После инкубации ЕС-клетки пересаживают в брюшные полости 1 СРС 1. мышей-самок (10 мышей в каждой группе)в количестве 10 клеток на мышь и6регистрируют случаи гибели животныхв течение 2 ч дней.Не наблюдается гибели животныхв течение 20 дней после пересадки мышам ЕС-клеток, обработанных предлагаемым веществом, Имеется несколько мышей, у которых отсутствует накоплениеасцита, С другой стороны, все мышиконтрольной группы, которым привитыЕС-клетки, погибают от опухоли в течение 20 дней после пересадки,Испытания противоопухолевой активности 1 п чиччо,Результаты испытаний противоопухолевой активности 1 п ч 1 чо на мышах икрысах приведены в табл. 6, Предлагаемое вещество показывает высокую противоопухолевую активность в каждом случае.Итак, получаемое вещество - полисахарид, связанный с белками, показывает очень эффективное действие приприменении в качестве противоопухолетвого вещества, вводимого стоматически. Предлагаемое вещество, кроме то 1 961565 12Таким образом, предлагаемое вещество является новым веществом, полученным из полисахаридов, связанных сбелками (Р В-К), происходящих из гриба, принадлежащего к Сог 1 о 1 цз, и не 5содержащим с-глюкан, согласно измерениям ЯМР, поэтому предлагаемое вещество должно отличаться от Р -К. Вещество легко идентифицировать посредствомоточного определения области поглоще"ния при измерениях ЯМР, поэтому тех"ника идентификации, относящаяся кпредлагаемому веществу является цен 4ным ориентиром при изучении сложных15высокомолекулярных веществ, извлечен"ныхиз природных материалов.Противоопухолевая активность. Испытания острой токсичности на мышахи крысах,При этих испытаниях используют мы"шей 1 СВС -га 1 п 4-5-недельного возраста, весящих 21-24 г, и крыс расыОапгцп 4-5-недельного возраста, ве"сящих 100-150 г. Предлагаемое вещест".во вводят следующими четырьмя спосо-25бами: внутривенно, подкожно, внутри"брюшинно и стоматически. Через 7 днейпосле введения вещества проводят на-.блюдения общих симптомов, гибели ивеса тела и.после завершения наблюде-,ний животных умерщвляют и вскрывают.Результаты испытаний острой .токсичности на мышах и крысах представлены втабл. 5. Даже введение максимальнойдозы не вызывает гибели животных -35ни крыс, ни мышей, и практически невозможно вычислить величины оОИспытания противоопухолевой активности.Противоопухолевая активность 1 пчЪсго.Подавляющая активность 1 и ч 11 гопротив роста клеток асцитической гепатомы АН, Исследуют концентрацию1.С , подавляющую рост на 504. Пред-лагаемое вещество, последовательноразбавленное, добавляют к суспензииклеток асцитической гепатомы АН и после 48-часового сращивания подсчитывают живые клетки методом окрашивания, чтобы определить подавление роста. Результат показывает, что1.СО предлагаемого вещества составляет 100 мг/мл.55Активность 1 п чего против ростаклеток асцита Эрлиха мышей, Исследуютвлияние предлагаемого вещества на поглощение Н-уридина и Н-тимидинаэкстракт и остаток от экстракции,и остаток от экстракции подвергают такой же обработке посредством экстакции,как упомянуто, используя каждый из водных растворителей, указанных в табл. 7, Каждый из экстрактов собирают и затем концентрируют, Концентрированный раствор экстракта- на" сыщают сульфатом аммония и получают осадок. Полученный осадок снова растворяют в воде и подвергают обессоливанию посредством диализа, используя целлюлозную мембрану. Полученный таким образом раствор концентрируют до 5 по весу, затем добавляют сульфат аммония в количестве, соответствующем 251 от величины насыщения. После удаления осадка, образовавшего" ся при упомянутой обработке к раст" вору снова добавляют сульфат аммония в количестве, соответствующем 40 от величины насыщения. Полученный осадок растворяют в воде и подвергают ,такому же обессоливанию, как упоминалось, затем пропускают через колон; ку с ДЭАЭ-целлюлозой. Адсорбированноем на колонке вещество промывают водои, затем вымывают одномолярным солевым раствором. В элеат сновв добавляют ,сульфат аммония в количестве 40 от величины насыщения и образовавшийся в результате осадок собирают и снова растворяют в воде, Полученный раствор обессоливают посредством диалиэа и концентрируют, затем высушивают распыливанием и получают посредством этого искомое вещество, Свойства полу-. ченного вещества и результаты его испытаний на животныхприведены в табл.7.Иетод щелочного экстрагирования с: применением в качестве растворителящелочи осуществляется так же, какописанный способ, эа исключением того, что вместо воды в повторной экст"ракции осадка применяют 1/10 н,. раст" вор едкого натра и после завершения экстракции доводят величину рН до нейтральной с помощью 1/10 н. солянойкислоты.В табл. 7 приводится инФракрасныйспектр поглощения, измеренный по способу таблеток в бромистом калии, который графически изображен на фиг. 1,на котором видно поглощение 4 ОН при 2600-3200 смдеформационные колеба" . ния " ИН и -йН при 1600 и 1530 см"й.соответственно, широкэе поглощение ; при 1200-1000 см " антисимметричные валентные колебания С-О-С-связи пи 13 61565го, придает способность к иммунитетучерез хозяина и является эффективнымдля предотвращения ухудшения или резкого падения иммунитета или Физической силы больных, которые прошли раЛличные курсы лечения, такие как химиотерапия, радиотерапия, хирургическаяоперация или переливание крови, неза- .висимо от того, были ли они пораженыраком или нет. Более того, предлага- ,1 Оемое вещество эффективно также длязащиты больных от инфекционных болезней, таких как гепатит или пневмония, которые могут быть вызваны заражением вирусами или бактериями в реэультате ослабления или упадка иммунитета или Физической силы.Кроме того, предлагаемое веществопри стоматическом введении больномуне только способствует улучшению 2 робщего Физического состояния, но также действует как облегчающее работукишечника и улучшающее аппетит больного. Предлагаемое вещество оказывается также очень полезным для улучше зния Функции кишечника больного, который длительное время лежит в постели.П р и м е р ы 1-4. Продуцентыкаждая линия СИ(ГЕРИ-Р И 2412СИ(ГЕРИ-Р йф 2413 и СИ зв.Сог 1 о 1 цэ чегосо 1 ог (Гг.) Оое 1, засевается в 200-миллилитровую коническую колбу, содержащую 30 мл питательной среды имеющей следующий состав, Ж: глюкоза 5, пептон 0,2,дрожжевой экстракт 0,3, КНРО 0,1и КАБО.7 НО 0,1. Культивированиеве 31 ут стационарно при 25-27 С в течение 10 дней и мицелиальную пленку 4 ввыросшую на поверхности питательнойсреды, гомогенизируют Физиологическимраствором для получения посевного материала. Посевной материал затем вы-.севают в каждую из однолитровых колбдля выращивания, содержащих 200 мп:той.ие самой питательной среды, и инкубируют при 25-27 С в течение 25,дней, чтобы посредством этого получить грибницу. Мицелиальныи выход со ставляет 4-4,3 г, на колбу для СИ,2,0-2,5 г для СМи 2,7-3,2 г дляСИЗатем к каждой полученной грибницу (,100 г) добавляют 3 л дистиллиро"ванной воды и каждую иэ грибниц экстра- Ягируит при перемешивании при 981; втечение 3 ч. После завершения экс-.тракции каждый раствор разделяют на-4но поглощение при 840 см(а(-связь)едва заметно, 3Так как большого различия в инфра"расных спектрах поглощения отдельныобразцов не отмечается, в качестве ти"пичного представителя даны результатыодного примера 1. 16Измерения ЯМР проводят, выбирая вкачестве внутреннего эталона ДСС и.;применяя в качестве растворителя тяжелую воду. Данные, приведенные втабл, 7, представляют собой величины 1 зосле коррекции в соответствии с до"пущением кривой Лоренца для устране"ния влияния остаточной легкой водыв тяжелой воде,Молекулярный вес предлагаемого ве" щщества измеряют, применяя метод ультрацентрифугирования. Он равен 5000- .300000 для всех образцов. Для измере"ния используют седиментационное рав-новесие и искусственную граничную мо здель, применяя интерференционную оп"тическую систему. Условия эксперимента следующие: концентрация образца0,33; растворитель 1/10 н. КС 1; температура 25 С; длина столбика раство" щра 1,7 мм; скорость 22000 обмин;время измерения 5 ч.Аминокислотный анализ выполняютв соответствии с обычным методом путем добавления 4 мл 6. н. соляной кислоты к 10 мг каждого образца, замораживая его в смеси сухого льда и ацеГона, запаивания образца в трубке подУменьшенным давлением, гидролизуя егов течение 24 ч, при 110 С высушиваяи затем растворяя в 30"40. мл лимоннокислого буферного раствора с величиной рН 2,20.При определении удельного вращениясначала измеряют оптическое вращениес 3"линией натрия ( 589 мм), используя0,253-ный водный раствор каждого образца и 5-сантиметровые ячейки и вычислЯют Удельное вРащение о 1 " из измеренного оптического вращения",ЯИзмерение моносахаридного составапредлагаемого вещества проводят сле",дующим образом. 3 мг каждого образцапомещают в 5-миллиметровую стекляннуюампулу, в которую добавляют 10 мл33"ного раствора хлористого водорода55в метаноле, и проводят метанолиз при100 С в течение 16 ч, Образовавшийсяпродукт нейтрализуют углекислым серебром и отфильтровывают при комнатной температуре. фильтрат упариваютдосуха и затем растворяют в 0,5 млсухого пиридинд,В.полученный раствор добавляют0,2 мл гексаметилдисилазана и 0,3 млтриметилхлорсилана и смесь оставляютстоять в течение 30 мин при комнатнойтемпературе, чтобы осуществить введение триметилсилильных групп. По завершении этого процесса смесь раст воряют в хлороформе и, после удаления избытка реагента промыванием во-дой, полученный раствор упаривают досуха. Обработанное таким образом вещество ( триметилсилат ) растворяютв четыреххлористом углероде и оценивают посредством газовой хроматографии.1Тип связи сахаридов определяют всоответствии со способом Хеуорса, Т.е.2 г каждого образца растворяют в 10 мл1 н. раствора йаОН и, поддерживая тем-,пературу смеси 40-50 С в токе азота,при интенсивном перемешивании добавляют по каплям 20 мл диметилсерной кислоты и 40 мл 30/-ного раствора гидроокиси натрия в течение нескольких часов. После отстаивания смеси в течение ночи ее подвергают такой же обработке тем же самым количеством метилирующего реагента. После нейтрали"зации реакционный раствор диализуют впротекающей воде, диалиэат концентрируют при уменьшенном давлении и подвергают трехкратному метилированию,После дополнительной нейтрализации идиализа смесь упаривают досуха приуменьшенном давлении, Оставшееся вещество растворяют в 20 мл смеси хлороформа с метанолом (10:1) и к раствору добавляют смесь петролейногоэфира и эфира (1:1) для осаждения метилированного вещества. Затем 20 мгэтого метилированного вещества подвергают гидролизу с 1 н. серной кислотой при 1000 С в течение 16 ч и продукт гидролиза обычным способом переводят в альдитолацетат, молярное соотношение определяют по площадям пиков на газовой хроматограмме. Для того, чтобы различить 2,3,6-три-О-Ме-би 2,3,4-три-О"Ме-б-, 20 .мг метилированного вещества подвергают метанолизу при 100 С в течение 16 ч в запаянной трубке, применяя 3-ный растворхлористого водорода в метаноле. Присутствие 2,3,4-три-О-Ме-б- впродук5 18ксперимента примера 1, когда испольуют грибки Сог 1 о 1 ц 5 чегэ 1 со 1 ог (Гге;це 1 (штамма ГЕРМ-Р Ю 2412). Другиексперименты проводят аналогично вайанту способа, описанному в примере 1,использованием штамма ГЕРИ-Р У 2712рибков Сог 1 о 1 цз рагяаяепцз (Гг.) Ра 1.ри этом также достигают лрактические же результаты, что и в ходе проведе-ия эксперимента примера 1. Свойстваолучаемых веществ приведены в табл,.Получаемые вещества имеют структуру, в которой белок связан с полиса"аридной частью. Предлагаемое вещесто не имеет запаха, безвкусно и расторимо в воде, имеет светло-коричнеую или коричневую окраску. Кроме тоо, предлагаемое вещество не имеет о 6 еделенной точки плавления и постеенно чернеет и разлагается при тем"Опухоль Способ получения продуктаПредла .Известгаемый ,ный,новооб"раэованиЭрлиха 1 ООах 10 95500 х 10 85 1000 х 10 85-90500 х 10 8 З60-65 50"55 Саркома я" дозиров женная мг/кг в день, у число наэначени а б л и ц а 2 1: Цветй езультаты Цветная реакция Пурпурн еакция сс-нафтолсерной кислотой ахариды ричневыи идолом .слотой еакция с сернойРеакция с антрономи серной кислотой еленоватоолубой оричневый еакция с фенолом серной кислотой 17 , 96156 те метанолиза не подтверждается газо"- э хроматографическим анализом. Каждый з из упомянутых продуктов разложения а идентифицируют по газовой хроматогра- э мме, используя эталон. Кроме того,э р каждый из упомянутых продуктов раз- с ложения выделяют, применяя жидкостную г хроматографию на колонке и/или крис- , П таллизуют или переводят в кристалли- т ческое производное, 0 нСвойства, структурные характерис- и тики и противоопухолеваЬактивность полученных таким образЬм веществполисахаридов, связанных с белками, показаны в табл. 7. 1 вПримеры 5 и 6. Проводят . вналогично примерам 1"4 с использова" в . нием штамма грибков ГЕРМ-Р У 2711 , г Сог 1 о 1 цэ Ы гэцйцэ (Гг.) Оце 1. Прир этом получают практически те.же самые 26 и результаты, что и в ходе проведенияиа