Способ получения пептидов

О П И С А Н И Е 245680ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советских Социалистических РеспубликК ПАТЕНТУ Зависимый от патента-Заявлено 12.Х 1.1966 ( 1112660/23-4)Приоритет 12,Х 1,1965,15637/65, ШвейцарОпубликовано 04 Х 1.1969. Бюллетень19 Кл, 12 ц, 6/01МПК С 071УДК 547.964.4.07 (088.8 Комитет по делам изобретений н открытий при Совете Министров СССР.196 Авторыизобретения но ранцыхард Риникеррия)я фирмаАГ еат Изелин, Хайни Каппелер, БеВернер Риттель аявитеЛЬ ностранн ЦИБ (Швей ПТИДО ОСОБ ПО 11 УЧЕ Предлагается способ получения пептиДов, которые обладают усиленным адренокортикотропным действием и отличаются от подобных известных пептидов тем, что в качестве первой и-аминокислоты в аминоконце они содержат Р-аминокислоту.Предметом изобретения является способ получения Р-серил.-тирозил.-серил-Ь-метионил Ь-глутамил-Ь - гистидил-Ь - фенилаланил- Ь-артинил-Ь - триптофилглицил - . - лизил - 1.- 10 пропил.-валилглицил-лизил.-лизил - 1.-лизил-.-лизил.-пропил-.-валил.-лизил-Ь - валил.-тирозил.-пролина, а также соответствующих соединений, которые вместо глутамилового остатка содержат остаток глутамина, 15 заключающийся в том, что защищенный декапептид Р-сер ил-тир озил-сер ил-метионил-глутамил (глутаминил) -гистидил-фенилаланиларгинил-триптофил-глицин конденсируют из. вестным способом, например карбодиимидным 20 или методом смешанных ангидридов, с эфиром или амидом тетрадекапептида лизил-пролил- валил-глицил-лизил-лизил-лизил - лизил - пролил-валил-лизил-валил-тирозил-пролина или с пептидами разной длины, в которых боковые 2 группы защищены, с последующим отцеплением защитных групп известным способом, например обработкой трифторуксусной кислотой.Новые соединения обладают значительно большим адренокортикотропным действием, 30 чем соответствующие соединения с Ь-конфигу рацией у первой аминокислоты. Их следует применять в медицине и ветеринарии, например вместо естественных гормонов.Новые пептиды получают методами, известными для получения пептидов с длинной цепью, с применением Р-аминокислоты в качестве Х-концевой аминокислоты. При этом аминокислоты присоединяются в вышеупомянутой последовательности отдельно или после предварительного образования более мелких пептидных группировок. Особенно следует выделить синтез на твердом носителе, согласно которому пептид образуется с карбоксильного конца, соединенного эфирообразно с полимером, путем последовательной конденсации аминокислот. В качестве методов конденсации следует упомянуть, например, карбодиимидный и азидный методы, метод активированного сложного эфира и ангидридный метод, Так, молекулу аминокислоты или пептида в виде сложного эфира можно присоединить к другой молекуле аминокислоты илн пептида, содержащего защищенную аминогруппу, в присутствии конденсирующего средства, например карбодиимида или галогенида сложного эфира фосфористой кислоты, Можно также провести реакцию обмена сложного эфира аминокислоты или пептида со свободной аминогруппой с аминокислотой или пептидом с активирован55 60 65 ной кар боксильной группой и защищенной аминогруппой (галогенид, азид, ангидрид, имидазолид, изоксазолид кислоты; активированный сложный эфир, например сложный цианметиловый эфир, сложный карбоксиметилтиоловый эфир или сложный нитрофениловый эфир). Чожно провести также реакцию аминокислоты или пептида со свободной карбоксильной группой и защищенной аминогруппой с аминокислотой или пептидом с активированной аминогруппой и защищенной карбоксильной группой, например с фосфитамидом.Не участвующие в реакции свободные функциональные группы целесообразно защищать остатками, особенно легкоотщепляемыми, путем гидролпза или восстановлением: карбоксильную - преимущественно путем этерификации, например, метанолом, третбутанолом, бензиловым, гг-нитробензиловым спиртами, или амидированием; аминогруппу - например, введением тозиловой, тритиловой, формиловой, трифторацетиловой, о-нитрофенилсульфениловой, фталиловой или карбобензоксигруппы либо цветных защитных групп, таких как и-фенилазо- и гг-(и-метоксифенилазо) -бензилоксикарбонильная группа, или особенно третбутилоксикарбонильного остатка. Для защиты аминогруппы в гуанидогруппировке аргинина пригодна нитрогруппа, но названная аминогруппа аргинина в реакции должна быть недостаточно защищенной. Иминогруппу гистидина можно защитить с помощью бензилового илп тритилового остатка.Преобразование защищенной амино- или иминогруппы в свободную группу, а также перевод функционально видоизмененной карбоксильной группы в свободную карбоксильную группу во время реакции осуществляют известными методами путем обработки гидролизирующими или восстанавливающими средствами,Предпочитаемый метод заключается в том, что трипептид, содержащий Н-Р-Сер-Тир-СерОН (все аминокислоты .-ряда, если Р-аминокислоты специально не оговариваются), или тетрапептид конденсируют с гепта- или гексапептидом последующих аминокислот до аминокислоты 10, преимущественно по азидному методу, а затем конденсируют декапептид с тетрадекапептидом аминокислот 11 - 24. В этом процессе конденсации в качестве метода соединения преимущественно применяют карбодиимидный метод или метод активированного сложного эфира, прежде всего, с помощью сложного гг-нитрофенилового эфира. В последнем случае не обязательно специально выделять сложный и-нитрофениловый эфир декапептида, но можно образовать его на какой-либо стадии конденсации из декапептида со свободной карбоксильной группой обработкой и-нитрофенолом и дициклогексилкарбодиимидом. Итак, декапептид применяют в виде а-аминозащищенного пептида со свободной карбоксильной группой или группой сложного и-нитрофенилового эфира. Тетрадекапептид 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 применяют в виде сложного эфира, преимуще ственно сложного третбутилового эфира или амида, Содержащиеся в конденсируемых частях пептидов аминогруппы боковых цепей преимущественно защищаются третбутилоксикарбсксильной группой, карбоксильные группы боковых цепей - третбутилэфирной группой. В последней стадии защитные группы можно отщепить с помощью трифторуксусной кислоты.По другой предпочитаемой технологии тетрапептид Н-Р-Сер-Тир-Сер-Мет-ОН, содержа. щий первые четыре аминокислоты, конденсируют с эйкозапептидом аминокислот 5 - 24. В процессе конденсации в качестве метода соединения применяют преимущественно азидный метод. а-Амидную группу тетрапептидгидразида или тетрапептидазида преимущественно защищают третбутилоксикарбонильной группой. Эйкозапептид можно применить в виде свободного пептида или сложного эфира, особенно сложного третбутилового эфира, или в виде Про 24-амида. Также в эйкозапептиде аминогруппы боковых цепей защищают с помощью третбутилоксикарбонильной группы, карбоксильную группу боковой цепи - с помощью группы сложного третбутилэфира.После того как путем конденсации пептидных группировок получен тетраикосапептид, а-аминогруппа и аминогруппы боковых цепей которого защищены третбутилоксикарбонильной группой, а концевая карбоксильная группа и карбоксильная группа боковой цепи - группой сложного третбутилового эфира, можно все эти защитные группы одновременно отщепить с помощью кислого гидролиза, например трифторуксусной кислотой. Если концевая карбоксильная группа представлена не группой сложного третбутилового эфира, а амидной группой, то получают пептидамиды, Пептидгидразиды получают, например, путеМ обработки концевой группы низшего алкильного эфира гидразингидразином.Изобретение касается также таких способов, в которых исходным материалом является промежуточный продукт какой-либо стадии про. цесса.Изобретение описывается в следующих при. мерах. Температуры даются в градусах по Цельсию. Системы тонкослойной хроматогра. фии обозначаются следующим образом: Система 43 А: гретамиловый спирт - изопро.панол - вода (100; 40: 10). Система 45: зторбутанол - 3/о-ный водныйаммиак (100: 44).Система 100: этилацетат - пиридин - ледяная уксусная кислота - вода (62: 21: 6: 11).Система 101; и-бутанол - пиридин - ледя.ная уксусная кислота - вода (30: 20: 6: 24) .Применяют следуощие сокращения: кбз - карбобензокси; БОК в третбутилоксикарбонил; тБ - третбутил,П р и м е р, 1). 1 О г кбз-Лиз(БОК)- Лиз(БОК)ОСНз (полученного из Лиз(БОК) - ОН+Н,Лиз(БОК)ОСН;с с помощью дицпклогексилкарбодиимида) растворяют в 160 лсл метанола и добавляют 7,8 мл гидразингидрата. Прозрачный раствор отстаивают при 25 С в течение 24 час и концентрируют до /з первоначального объема. При добавлении 200 мл воды выпадает маслянистый осадок, который при охлаждении и отделении отверждается и из которого можно получить порошок. Порошок промывают водой и высушивают. Продукт очищают путем однократной перекристаллизации из смеси метанолсложный уксусныи эфир - петролейный эфир, Получают продукт с т. пл. 118 - 119,5 С, На тонкослойных силикагельных пластинках получают следующие значения И:(43 А) 0,40 (хлороформ - метанол - 9:1) 0,75.2), Кбз-Лиз (БОК) -Лиз (БОК) -пролин.1,87 г кбз-Лиз (БОК) -Лиз (БОК) гидразидарастворяют в 15 мл свежедистиллированного диметилформамида и охлаждают до - 25 С, Медленно добавляют каплями 2,07 дсл 4,35 н.соляной кислоты и затем О,бб мл 5 н, раствора нитрита натрия, Перемешивают в течение 10 мин при - 10 С и добавляют раствор 692 мг Е-пролина в 4,2 мл смеси диметилформамида с водой (2: 1), Затем при - 10 С каплями еще добавляют 1,82 мл триэтиламина и отстаивают реакционный раствор и р и 0 С в течение ночи и еще 2 час уже при комнатной температуре. Затем концентрируют под высоким вакуумом до объема 4 мл и добавляют в клейкий остаток 25 мл воды, При охлаждении до 0 С растирают в порошок, Нутчуют, промывают небольшим количеством воды, высушивают под высоким вакуумом при 40 С.Для очистки некристаллизирующегося сырого продукта проводят многократное распределение по Крейгу в системе растворителя метанол - буфер - хлороформ - четыреххлористый углерод - (35:13:15:15 (буфер - 28,5 мл ледяной уксусной кислоты+19,25 г ацетата аммония в 960 мл воды) с фазовыми объемами по 10 мл. После 220 стадий из распределительных элементов49-73 (г мас,с=61; к=0,39) путем концентрации досуха и сублимации ацетата аммония выделяют хром атографически .истое, но аморфное производное трипептида с т. пл. 70 - 80 С. Тонкослойная хроматограмма на силикагели дает следующие значения К 1:(БОК) -Вал-Тир-Про-ОТБ.2,4 г кбз-ЛИЗ(БОК)-Лиз(БОК)-пролина и3,12 г Вал-Лиз-Лиз (БОК) -Вал-Тир-Про-ОТБ . растворяют в 30 мл аосолютного хлороформа,при 0 С добавляют 0,845 г дициклогекснлкар бсдиимида, перемешивают прп 0 С 1 чпс и отстаивают прп 25 С 30 чпс. Выпавшусо в осадок кристаллическую дициклогекснлмочевину 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 5560 65 огфильтровывают и промывают в небольшом количестве эфира уксусной кислоты. В фильтрат добавляют 150 мл эфира уксусной кислоты и трижды экстрагируют органическую фазу при 0 С по 30 яг 3/о-ным раствором винной кислоты для удаления избыточного пентапептида, промывают несколько раз водой до нейтральной реакции и выпаривают досуха. Для выделения липофильных загрязнений остаток растворяют в 10 лсл метанола н 20 м,г эфира уксусной кислоты и добавлением 120 мл петролейного эфира осаждают октапептнд в виде маслянистой массы, которую сушат под вакуумом при 40 С. Полученный таким образом сырой продукт (3,1 г) подвергают окончательной очистке путем распределения по Крейгу в системе метанол - буфер - хлороформ - четыреххлористый углерод в : 10: 3; 30 (буФер тот же, что и в п. 2) по 225 стадиям с фазсвыми объемами по 10 лсл. Хроматографически однообразное производное октапептида получают при концентрации содержания элементов65 - 96 (ц.,=78, к=0,53) досуха и удалении ацетата аммония сублимацией под высоким вакуумом. Белый аморфный продукт имеет т. пл. 130 - 140 С. На силикагели продукт имеет следующие значения И:Система (43 А) 0,74;(бензол - ацетон - 1:1) 0,33.4) . Лиз (БОК) -Лиз (БОК) -Про - Вал - Лиз (БОК) -Вал-Тир-Пор-ОТБ.1,46 г кбз-Лиз (БОК) -Лиз (БОК) -Про-ВалЛиз(БОК) -Вал-Тир-Про-ОТБ после добавления 300 мг 10/о-ного палладированного угля гидриоуют в 40 мл метанола при встряхивании с абсорбцией двуокиси углерода. Поглощение водорода заканчивается уже через 20 мин. Через 1 час отфильтровывают катализатор, промывают метанолом и выпаривают фильтрат досуха. Получают значительный количественный выход хроматографически однородного дикарбобензоксилированного производного октапептида в виде белого порошка с т. пл. 110 - 120 С.По тонкослойной хроматограмме на силнкагели продукт имеет следующие значения И:(хлороформ - метанол - 9:1) 0,34,5) . Кбз-Лиз (БОК) -Про-Вал-Глу-Лиз (БОК) - Лиз (БОК) -Лиз (БОК) -Лиз (БОК) -Про - ВалЛиз (БОК) -Вал-Тир-Про-ОТБ,1,98 г кбз-Лиз (БОК) -Про-Вал-Глу - Лнз(БОК) -Лиз(БОК) гидразида растворяют в 22 лсл абсолютного диметилформамнда и после охлаждения до - 25 С при перемешивании по каплям добавляют 3,4 мл 2,115 н. соляной кислоты и затем 0,378 м,г 5 н. раствора нитрита натрия. Прозрачный раствор при - 10 С продслжают перемешивать и затем добавляют5 10 15 7предварительно охлажденный до - 5 С раствор 1,313 г вышеописанного производного октапептида в 4 мл диметилформамида. Промывают 1 мл диметилформамида и затем медленно при - 5 С по каплям добавляют 1,05 мл триэтиламина, Реакционную смесь еще перемешивают 30 мин, отстаивают при 0 С, 15 час, а затем концентрируют до образования вязкого масла и осаждают из него при добавлении 20 мл воды маслянистую массу. Массу при нагревании снова растворяют в 20 мл метанола и снова осаждают пептид при добавлении 30 мл воды, При охлаждении до 0 С и растирании получают порошковую массу, которую фильтруют, промывают водой и высушивают. Для очистки полученный сырой продукт подвергают распределению по Крейгу в системе метанол - буфер - хлороформ - четыреххлористый углерод - 60:20:3;60 (буфер, как в и. 2) с фазовыми объемами по 20 мл, После 218 стадии из элементов105 в 1 (14,4 = 121, к= 1,25) путем концентрации досуха и удаления сублимации ацетата аммония под высоким вакуумом выделяют хроматографически однородный защищенный тетрадекапептид в виде белого аморфного порошка с т. пл.180 - 190 С, Продукт на силикагели имеет следующие значения К 1;(43 А) 0,80 (хлороформ - метанол - 9:1) 0,496) . Лиз (БОК) -Про-Вал-Глу-Лиз (БОК) -Лиз(БОК) -Лиз (БОК) -Лиз (БОК) -Про-Вал - Лиз(БОК) -Вал-Тир-Про-ОТБ.1,66 г кбз-Лиз(БОК) - Про-Вал-Глу-Лиз(БОК) - Лиз(БОК) - Лиз(БОК) - Лиз(БОК)- Про-Вал-Лиз (БОК) -Вал-Тир-Про-ОТБ гидрируют обычным способом в 40 мл метанола с 300 мг палладированного угля (10% Рд), При концентрировании фильтрованного раствора гидрирования досуха получают непосредственно хром атографически однородный продукт (1,49 г) в виде аморфного порошка, который нередко плавится при 175 - 190 С. На силикагели продукт дает следующие значения К 1;(хлороформ - метанол - 9:1) 0,24.7), БОК-Р-Сер-Тир-Сер-Мет-Глу(ОТБ) -ГисФен-Арг-Три-Глу-Лиз(БОК)-Про - Вал - ГлуЛиз (БОК) -Лиз (БОК) -Лиз (БОК) - Лиз (БОК)- Про-Вал-Лиз (БОК) -Вал-Тир-Про-ОТБ.378 мг БОК-Р-Сер-Тир-Сер-Мет-Глу(ОТБ)- Гис-Фен-Арг-Три-глутаминовой кислоты и 451 мг Лиз(БОК) -Про-Вал-Глу-Лиз(БОК)- Лиз(БОК)-Лиз(БОК)- Лиз(БОК) - Про - ВалЛиз(БОК)-Вал-Тир-Про-ОТБ суспендируют в 4 мл абсолютного пиридина и после добавки 0,15 мл воды и 0,32 мл 1 н. соляной кислоты перемешивают при 50 С 10 мин, Затем в мутную суспензию добавляют 145 мг дициклогексилкарбодиимида и после отстаивания в течение 3 час еще раз добавляют такое же количество. Перемешивают 3 час при 50 С и затем отстдищют в течение ночи. Выпавшую в оса 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5 док дициклогексилмочевину отфильтровывают и трижды промывают по 0,8 мл 90-ным пиридином. В фильтрат добавляют 45 мл бензола, причем выпадает порошкообразный сырой продукт, который отфильтровывают и сушат при 45 С. Путем переосаждения из метанолбензол-петролейного эфира выделяют наибольшую часть липофильных примесей, после чего проводят окончательную очистку распределением по Крейгу в системе растворителей метанол - буфер - хлороформ - четыреххлористый углерод - 10:3,17:5:4 (буфер применяют согласно п, 2) по 300 стадиям с фазовыми объемами по 10 мл, Из распределительных элементов51 - 85 (14,44 ц =67 к=0,29) путем концентрирования досуха и сублимации ацетата аммония при 40 С под высоким вакуумом выделяют 445 г хроматографически чистого защищенного тетраикосапептидацетата в виде аморфного порошка с т, пл. 205 - 210 С (с разл.). Продукт на силикагели дает следующие значения Ю:(43 А) 0,63 (100) 0,60 (хлороформ - метанол - 75:25) 0,42.8). Р-Сер-Тир-Сер-Мет-Глу-Гис-Фен - АргТри-Глу-Лиз-Про-Вал-Глу-Лиз-Лиз-Лиз - ЛизПро-Вал-Лиз-Вал - Тир - пролин (Р - Сер 4Лиз 47 48-ф 4 4-кортикотропин),370 мг защищенного производного тетраикосапептида растворяют в 7,4 мл 90-ной трифторуксусной кислотой и отстаиваютпри 25 С 45 мин, Затем раствор концентрируют до 2 мл, разбавляют 20 мл воды, еще раз концентрируют и, наконец, лиофилизируют, Получают трифторацетат свободного тетракозапептида, который для преобразования в ацетат растворяют в небольшом количестве воды и фильтруют в виде ацетата через колонну (=12,5 мм, 1=15 см) со слабоосновным ионообменником, например Мерк=11. Элюат концентрируют до 3 мл, лиофилизируют и сушат под высоким вакуумом при 40 С. Получают 316 мг хроматографически и электрофоретически однородного ацетата Р = Сер 4-Лиз 47-48 Р 4 - 24-кортикотропина в виде белого аморфного порошка.По тонкослойной хроматограмме на окиси алюминия в системе 101 соединение дает значение К 1 0,40 (р 4 4-кортикотропин при таких же условиях дает 0,51). При электрофорезе (16 об/см) цри рН 6,1 (пиридинацетатный буфер) продукт переходит на 8,4 см к катоду в течение 2 час.Предмет изобретенияСпособ получения пептидов Р-серил 4-лизил 47 - 48-р 4-24-кортикотропина или Р-серил 4- глутаминил 4-лизил 47 - 48-р 4 4-кортикотропина и их амидов, отличаюи 4 ийся тем, что защищенный декапептид Р-серил-тирозил-серил-метионил-глутамил (глутаминил) -гистидил-фенилаланил-аргинил-триптофил-глицин конденсируют известным способом, например карбодиимидным или методом смешанных ангидриЗаказ 2298/18 Тираж 480 ПодписноеЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР Москва, Центр, пр. Серова, д. 4 Типография, пр. Сапунова, 2 дов, с эфиром или амидом тетрадекапептида лизил-пролил-валил-глицил-лизил - лизил - лизил-лизил-пролил-валил-лизил-валил- тирозилпролина или с пептидами разной длины, боковые группы которых защищены, с последующим отцеплением защитных групп известнымспособом, например обработкой трифторуксуснои кислоты.