Способ получения рестриктирующей эндонуклеазы sau 6782

1796676 3Поставленная цель достигается тем, что элюируется узким пиком в области 0,4-0,45в способе получения рестриктазы Яац 6782 М МаО, а неспецифические нуклеазы - .катионообменную хроматографию на фос- близкими концентрациями йаС 1 0,45-0.55фоцеллюлоэе РИ осуществляют непосредст- М (фиг 1, пример 1),венно после высаливания белков с 5 - ПолученныйпрепаратКЯаи 6782 содериспользованием двойного комбинирован- жит незначительное количество неспецифиного градиента повышающейся концентра- ческих примесей, Выход ферментации хлористого натрия от 0,0 до 1,0 М и составляет 1300 ЕД из 1 г биомассы. Активснижающихся значений рН от 9 до 6. ность - 250 ЕД/мл. Удельная активностьЗа единицу активности препаратов ре- "О 60000 ед/мг. "стриктаэы принимают количество мкл фер- . П р и. м е р 2. Культивирование клеток,мента, вызывающих полный гидролиз 1 мкг их разрушение, получение грубого экстракДНК фага Лза 1 ч инкубации при 37 С. та, освобождение от нуклеиновых кислот иРеакцию рестрикций проводят в инку- высаливание белков ведут, как в примере 1,бационной смеси обьемом 30 мкл следую- "5 Осадок растворяют в рабочем буфере рН 8щего состава: 0,06 М трис-НС рН 7,5, 0,015 до конечной концентрации 2 мг/мл, диали- .М МдС 2 О 06 М ИаС; 7 мМ р-меркаптоэта- зуют против РБ и наносят на колонку 1,2 х 10нала, 1 ЕД рестриктазы, 1 мкг ДНК фага Л, см с ФЦ, уравновешенную тем же буферомРестриктазную активность тестиру 1 от со скоростью 10 мл/ч. Колонку промываютпри горизонтальном электрофорезе в 1 ф/, 20 тремя объемами буфера иферментэлюируагарозном геле. Гель окрашивают раство- ютдвойным комбинированным градиентомром этидия бромида в концентрации 3 повышающейся концентрации МаС от 0,0мкг/мл 20 мин и фотографируют в ультрафи- до 1,0 М и снижающихся значений рН от 8олетовом свете при 254 нМ с красным све- до 7. При этих условиях рестриктаза элюитофильтром,25 руется 04 - 0;5 М йаО и отделяется от неспеУдельная активность выражается в цифических нуклеаз, обнаруживаемых вединицах активности на 1 мг белка, Кон- зоне 0,55 - 0,65 М МаС с хорошим разреше, центрацию белка определяютспектрофото- нием,метрически, Полученйый таким способом препаратПримеры конкретного осуществления 30 Й Яац 6782 полностью свободен от неспециспособа. фических примесей и пригоден для любыхП р и м е.р 1. Клетки Я/аигеоз 6782 видов структурных исследований. Выходкультивируют в ферментере на среде, при- фермента 1500 ЕД на 1 г биомассы, Удельготовленной на основе триптического гид- ная активность 70000 ЕД/мг, Активностьролизата казвина и дрожжевой воды, и 35 3000 ЕД/мл.осаждают центрифугированием. Бактери- П р и м е р 3. Все этапы вплоть доальную массу суспендируют в рабочем бу- хроматографическойочистки, как в примерефере (РБ) рН 7,4, содержащем 10 мМ:1. Ферменты элюируют градиентом повыК-фосфат, 7 мМ р -меркаптоэтанол и 1 мМ шающейся концентрации йаС от 0,0 до 1,0ЭДТА, добавляют лиэостафин и инкубируют 40 М и понижающихся значений рН ат 7,5 до 7,20 мин при 20 С. Полученную клеточную При этих условиях рестриктаза элюируетсясуспенэию подвергают ультразвуковойдез,40-0,55 М ИаС, а неспецифические нукинтеграции и центрифугируют при 105 тыс. леазы -0 50-0,65 М йаС. Следовательно, в9 1 ч.Надосадочная жидкость представляет. условиях более пологого градиента пикисобой грубый экстракт. Освобождение от 45 оказываются размытыми и эффективногонуклеиновых кислот осуществляют с по- разделения ферментов не происходит, Вмощью сульфата стрептомицина, Высалива- препарате В Яаи 6782 содержатся примесиние белков проводят сульфатом аммония нуклеаз, Выход фермента 1200 ед/г, Актив(СА) 800 насыщения, Осадок оастворяют в ность 2000 ед/мл. Удельная активностьРБ рН 9 до конечной концентрации 2 мг/мл, 50 55000 ед/мг.диалиэуют от СА и наносят на колонку Для стандартной процедуры выделения1,2 х 10 см с ФЦ, уравновешенную тем же фермента был выбран пример 2.буфером со скоростью 10 мл/ч, Колонку про- Доказательства высокой степени чистомывают тремя объемами РБ и элюируют ты ферментного препарата получены прифермент двойным комбинированным гра использованиисовременныхтестов(фиг.2),диентом повышающейся концентрации Тестирование экзонуклеазных примейаС от 0,0 до 1 О М и снижающихся значе- сеи осуществлялось по степени лигирований рН от 9 до 6. Объем градиента 80 мл, ния фрагментов рестрикции, Полученные всобираемой фракции 4 мл. Рестриктаза результате гидролиза А Яао 6782 фрагментыДНК фага Ллигировались ДНК-лигазой фа196676 Характеристика препарата Р Зао 6782 га Т 4 с эффективностью более 90;О. Однако . абсолютные доказательства отсутствия следовых количеств зкзонуклеаз в препарате Р Зац 6782 получены при инкубации 14-член- ного синтетического меченого 32 Р олиго нуклеотида (ОНД); не имеющего сайта.узнавания для исследуемого фермента, с Р Зав 6782, При инкубации ОНД с Р в течение 18 ч на радиоавтограмме была получена лишь исходная полоса, что свидетельствует 10 об исчерпывающем освобокдении фермента от сопутствующих экзонуклеаз,Тестирование неспецифических зндонуклеазных примесей проводили путем длительной в течение 36 ч инкубации ДНК фага 15 Л с избытком ферментного препарата. Различий со стандартной картиной гидролиза не обнаружено, что свидетельствует об отсутствии неспецифических зндонуклеаз в препарате фермента, 20Полученный таким способом препарат Р Зао 6782 полностью свободен от неспецифических примесей и пригоден для любых видов структурных исследований, Выход фермента 1500 ЕД на 1 г биомассы. Удель ная активность 70 тыс. ед/мг белка. Активность 3 тыс. ЕД/мл, Препаратхранится при -20 С в течение 3 лет без потери активности.Сравнение показателей ферментного препарата Я Зац 6782, полученных по пред лагаемому способу и прототипу, представлено в таблице. Как видно из таблицы, предлагаемый способ позволяет увеличить выход и активность Й Зав 6782 в 1,5 раза, а также повысить его стабильность при хранении. Кроме того, предлагаемый способ более простой и технологичный и требует меньше времени для реализации,Формула изо 6 рете н ия Способ получения рестриктирующей эндонуклеазы Зао 6782, включающий культивирование продуцирующего микроорганизма З 1 арпу 1 ососсоз ацгеоз 6782, обработку бактериальной массы лизостафином, ультразвуковую дезинтеграцию, удаление нуклеиновых кислот сульфатом стрептомицина, высэливание белков сульфатом аммония, катионообменную хроматографию на фосфоцеллюлозе Р 1, о т л ичающийся тем,что,сцельюупрощения способа, сокращения продолжительности процесса и повышения выхода целевого продукта, катионообменную хроматографию на фосфоцеллюлозе Р И осуществляют непосредственно после высаливания белков с использованием двойного комбинированного градиента повышающейся концентрации хлористого натрия от О,О до 1,0 М и снижающихся значений рН от 9,0 до 6,0,. 7 естглование нрияесеН неспецифических нуклеаэ в препарате Е.5 ь 0782.Фа/ Лигирсваюе фрагиалов рестрикции /электрофорез в агарозе/.актов рестрикции 1 ест с синтстлческил мечени слигонуклеотидоы Р ОНД /контроль/ ре часо 2 трек течение Составитель И. Никольская-Сановичедактор О. Стенина Техред М. Моргентал Корректор т Подписноениям и открытиям при ГКНТ ССя наб 4/5 оизводственно-издательский комби тент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 10 1 трек- ф фага /конт . 2 трек- .,рагвентц ДЯ -а3 трек- ли. ировзние фраг 14-членннй синтетическими 1 ечени СЯ после инкубацы с И.5 лг Лс Заказ 632 Тираж ВНИИПИ Государственного комитета по изобре 113035, Москва, Ж, Раушс