Способ получения препаратов иммобилизованных ферментов

иблиот Союз Советских Социалистических Республик(11) 5 22189 ЮРСКОМУ СВИДЕЛ ЛЬСУВУ 61) Дополнительное к авт, свидД 1) М. Кл.о(45) Дата опубликоваии аоударстаеииыи хамитеСовета Мииистров СССРпо делам изаоретенийи открытий 6,Бюллетень 27 описания,06.09. 76(72) Авторы иэобретен Е. Браудо и В, Б. Толстогузов 71) Заявите СССР гигут элементоорганических соединени 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ИММОБИЛИЗОВАННБ 1 Х ФЕРМЕНТОВ Изобрете чения прела Нов для исп ие относится к способам полуатов иммобилизованных ферменльзования их в промышленных едлвгаемый способ получения ожет обеспечить более эффекввнению с ранее описанными пользование в промышленных рментов, иммобилизованных в ьку цри употреблении препараых предлагаемым способом, вг.- колоннвх возникает псевдоожиянке, что приводит к уменьшеамического сопротивления.рагы могут найти применениепроизводстве, в частности лепрепаратов, в также в пищевой ости,льзовании препаратов иммобилизованны,билизвци ких преп ло принц ной рвзн . имм обил смесью. условиях. П ипиаль ости и зованнПредла ь препарат иммобилизоввнных фермензвдвнным значением удельного веса,Задача регулирования удельного веса препаратов иммобилизоевнных ферментов ранее внаучно-технической или патентной литературе,не стввилвсь. Необходимо отметить, что ужеизвестен способ модификации свойств препа;ратов иммобилизоввнных на целлюлозе ферментов путем введения в них суспензии фер,ромагнитных частиц.Однако эгв операция преследует узкуюцель и проводится для осуществления магнитной сепврв 4 ни частиц катализатора, уносимыхпотсзсом реакционной смеси.Метод достаточно сложен н не обладаетнеобходимой универсальностью,лучвт тов с арственных ромышленн Известны различные с зации ферментов путем в левые матрицы,Наиболее эффективный ния крупномасштабных пр ся в проведении химическ доожиженном (флюиднзир нако до настоящего времпособы имм лючения их листаде- чаетпособ ос цессов заклю оя ревкции в псев. Од- исвином) слое 1 н вопрос об препаратов м тивное по ср способами ис установках фв гелях, поскол гов, полученн реакционных женное состо нию гидродинЗги препа в химическом евдоожиженном слое не етаее известных способах иммоенгов в гелях применение гав псевдоожйженном, слое,быо невозможно из-за ничгожлогностей между препаратами ых ферментов и реакционной гаемый способ позволяет по 522189ч р -ргде Х - объемная доля наполнигеяя;ч- удельный вес наполннтеля;р - удельный вес наполненного геля;Р - удельный вес ненаполненного геля,тПоследняя величина принимается равной 1 г/см .Значение удельного веса препарата иммобилиэованного фермента, необходимое для, осуществления состояния псевдоожижения,может быть рассчигано по формулеАгВе -:В В этих формулахЮ - скорость движения твердой часцы относительно среды;б - дяаметр частицыу - кииемагяческая вязкость среды;- ускорение силы тяжести;- удельный аес частицы; р - удельный аес средЫ,ТПредлагаемый способ дает возможнос гулироаагь удельный вес (плогносгь) гьяре ф Предлагается способ получения препаратов иммобилизованных ферментов введением фермента в раствор гелеобразующих веществ с последующим переводом раствора а гель, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности препаратов путем использования их в псевдоожиженном слое, в раствор гелеобразующих веществ вводяг мелкодисперсный инертный наполнигель.гДля получения препаратов иммобилизованных ферменгов с заданным значением удельного веса в качестве наполнигеля применяют химически инертные твердые веществ;з ва с уд. в. 2,4-113 г/см . Такими матеРиалами могут быть индивидуальные окислы 3 металлов и немегаллов, например ЪПО,ОЯ,М О., Т 1 0, Ь 1 О, измельченные химически инертные силикатные материалы, напри мер доменный шлак, стекло, а также металлы а мелкодисперсном состоянии, .например стальные опилки, порошкообраэные цинк и свинец,Для предотвращения взаимодейсзеия металла с ферментом или окружающей средой предлагается наносить на металлические час; гицы тонкие слои полимерных покрытий.Объемная доля наполнигеля в препарате иммобилизованного фермента моиет составлять 0,08-06 предпочтительно 008-0,Ф. Значение объемной доли наполнителя, требуемое для достижения заданного значения удельного веса препарата, может быть рас- считано по формуле р парагов ферментов, иммобилизоаанных в гелях, в интервале 1,8-7,2 г/см, что позвозляет использоаагь иммобилиэоаанные ферменты а качестве катализаторов реакций, прсьтекающих в псеадоожиженном слое. Преимущества процессов, протекающих в псевдоожиженном слое, по сравнению с процессами,основанными на использовании стационарногослоя катализатора, заключаются а повышении эффективности использования препаратовферментов, а именно в более высокой скорости тепдо- и массообмена, в меньшем расходе энергии, а также а более эффективноми равномерном исцользовании всего объемаюактора, гак как псевдоожижение позволяетустранить недостатка, саязанны с уплогненцьм слоя катализатора,П р и м е р 1. Гжовят препарат гпкжоэоксцдазы иммобилизоааиной в полиакрнлэизщноВФ геле. Для эгогО О 7 г метилен-бис-акриламида растворяют в 50 мл воды,в этот раствор анасяг 3,5 г акриламида ипосле его полного растворения 1 мг глюко;эоксидазы. Для повнпения удельного весапрейар га иммобилизованной глкжозоксидазыдо 1,8 г/см к исходной смеси добавляютЪ547 г:порошкообразной окиси цинка (уд.а.5,6 г/см) что соответствует объемной доле наполнигеля, равной 0,17. Затем в исход,Фнув смесь вводят 0,025 мл гетраэгилме-,тилендиамина и 0,25 мл 10%-ного водного раствора персульфага аммония. Послеэтого оставляют смесь на 2 час. И результате сополимериэации акрнламида я межлен-бис-акриламида образуется гель, содержащай фермент (глюкозоксидазу) и наполнигель" . а"Аналогично готовят препарат иммобили"зованной глюкозоксидазы, не содержащийнаполнигеля, Сравнивают ферменгагивную активность обоих препаратов, измеряя начальную скорость реакций окисления глюкозыметодом РН-сгагировання. Сущность методазаключается в регистрации количества едкого натра, пошедшего на гитрование глюконовой кислоты, образующейся в результате гидролиза глюконолак гона, продукта реакцииокисления глюкозы, кагализируемой глюкозоксидаэой.Реакцию проводят при 22 С и РН 5,7,при перемешивании а присутствии 0,1 н. хлористого натрия, отношение фермент:субстрат1:1000.Активность обоих препаратов была одинаковой и составляла 55% ог активности неиммобилизованной глюкозоксидазы. Следовательно, присутствие наполнигеля (окиси цинка) не оказывает влияния на ферменгативнуюактивность глюкозоксидазы,П р и м е р 2, Готовят препарат глюкоэоксидазы, иммобилизованной в полиакриламидном геле, как описано в примере 1, но вместо окиси цинка в исходный раствор вводят измельченный до порошкообразного состояния 5 доменный шлак (уд.в, 2,8 г/см) в количестве 110 г, что соответствует объемной доле ,0,44, Получают препарат с уд,в, 1,3 г/см.П р и м е р 3. Готовят препарат глюке зоксидазы, иммобилизованной в полиакриламидном геле, как описано в примере 1, но вместо окиси цинка в исходный раствор вводят. окись хрома (уд.в, 5,2 г/см ) в коли,честве 159 г, что соответствует объемной доле 0,35. Получают препарат суд.в. 2,0 г/сУ Активность препарата составляет 45% от активности неиммобилизованной глюкозоксидезы,. П р и м е р 4. Готовят препарат глюко.зоксидазы, иммобилизованной в полиакрил- М амидном геле, как описано в примере 1, но вместо окиси цинка в исходный раствор вводят стальные опилки (уд.в. 7,8 г/см ) в количестве 306 г, что соответствует объемной доле 0,44, Получают препарат с 25 уд.в. 4,0 г/см .3П р и м е р 5. Готовят препарат глюко,зоксидазы, иммобилизованной в полиакриламидном геле, квк описано в примере 4, но :,стальные опилки предварительно обрабаты- ЗО вают препаратом "виникс", представляющим собой раствор поливинилхлорида в хлороформе, после чего стальные опилки подвергают распылительной сушке, Обработка стальных опилок, заключается в их перемешивании ва препарате "виникс" в течение 10 мин при комнатной температуре, В результате обработки и последующей расцылительной сушки стальные опилки покрываются тонким слоем поливинилхлор яда. 49П р и м е р 6. Готовят препарат глюкозоксидазы, иммобилизованной в полиакриламидном геле, как описано в примере 1, но ,вместо окиси цинка в исходный раствор ввощят порошкообразный свинец (уд.в. 11,3 г/см)И ,в количестве 843 г, что соответствует объемной доле 0,60. Получают препарат с уд.в.7,2 г/см .ЪП р и м е р 7. Готовят препарат с- -химотрицсина, иммобилизованногов комплексном 59 геле, Для этого к 20 мл 0,5%-ного водного раствора альгината натрия, содержащего 0,5% ,сФ- -химотрипсинв, прибавляют по каплям и при перемещивании 25 мл 1%-ного водного раствора этилированного аминоэфира поли метакрилоаой кислоты. рН растворов 8,0, температура 18 оС. В результате взаимодействия противоположно заряженных полиэлектролитов (вльгннага натрия и этилированно- - аминоэфира полиметвкрнловой кислоты) Ю образуется комплексный гель, содержащий-химотрипсин. Для повышения удельного весе геля до 1,8 г/см в исходный раствор ;альгината натрия, содержащий с- -химотрипсин, вводят при перемешивании 143 г 1 порошкообразной двуокиси кремния (уд.в.ь ,2,4 г/см), что соответствует объемной до ,ле в исходной смеси и в комплексном гелеравной 0,57. Образовавшийся комплексный ,гель промывают водой и оставляют стоять ,под слоем дистиллированной воды 5 сток. Полученный препарат иммобилизованногоз , о- -химотрипсина имеет уд.в. 1,8 г/см .Активность препарата о -химотрипсина арактеризуют по начальной скорости гидроиэа этилового эфира Я -ацетил тирэина. Скорость реакции определяют методом рН-статирования, регистрируя количество ед,кого натра, пошедшего на титроввние образующегося при гидролизе И -ацетил- Ь - ,-тирозина. Реакцию проводят при 25 оС и ,рН 8,2 в присутствии 0,1 н, хлористого натрия, Отношение фермент;субстрат 1; 1 000. Активность иммобилизованного с- -химот рипсина составляет 15% от активности неиммобилиэованного фермента, т,е. равняется ,активности о -химотрипсина, иммобилиэованного тем же методом, но в отсутствие наполнителя. Следовательно, присутствие наполнителя не оказывает влияния ивактивностьиммобилизованного с. -химотрипсина,П р и м е р 8, Готовят препарат а.-химотрицсинаиммобилизованного в комплексном геле, как описано в примере 7, но вместо двуокиси кремния в водный раствор альгинвта натрия и сА. -химотрипсина вводят порошкообразный свинец (уд.в, 11,3 г/смэ) в количестве 44,2 г, что соответствует объемной доле 0,08. Частицы свинца предвари,тельно покрывают слоем поливинилхлорида, ,для чего порошок свинца взбалтывают в течение 10 мин в препарате "виникс, после че "го подвергают рвспылительвой сушке, Препарат иммобилизовакного с -химотрипсина имеет уд.в, 1,8 г/см . Активность иммобиЪлизованного сА. -химотрипсина составляет 12% от активности неиммобилизоввнного фермента.П р и м е р 9, Готовят препарат Ф- -химотрнпсина, иммобилизоввнного в комплексном геле, квк описано в примере 7, но вместо двуокиси кремния и водный раствор альгината натрия и с -химотрипсинв вводят порошкообразное стекло (уд.в. 2,5 г/см ) в количестве 127 г, что соответствует объемной доле 0,53, Получают препарат с уд.в,1,8 г/см3П р и м е р 10, 235 мг акриламида и15 мг метнлен-бнс-акриламида растворяют в 2,3 мл 0,5 М фосфатного буфера с рН522189 ТиРаж 575 Подписное филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 77,6 Далее при непрерывном перемешивании в раствор вводят 1 мг лактатдегидрогеназы с активностью 20000 ед./мг (по Бюхнеру) и 0,1 мл 5%-ного водного раствора Р -диметиламинопропионитрила. Далее в этот раствор добавляют при перемешивании порошкообразную двуокись титана (уд.в, 4,0 г/см )з в количестве 11,0 г, что соответствует обт- емной доле 0,50, и наконец, 0,1 мл 5 О/о-ного водного раствора персульфата аммония, Полученную смесь выдерживают на ледяной бане в течение 30 мин. Полученный гель измельчают и промывают водой.ферментативную активность определяют, пропуская раствор пирувата и гидрированно-. го кофермента, НАД Н, через колонку, эа 15 полненную частицами препарата иммобилизованной лактатдегидрогеназы. Концентрацию НАД определяют спектрофотометрически,Активность препарата 178 ед./мл частиц .геля, тогда как активность препарата фермента, иммобилизованного аналогичным образом, но без добавления двуокиси титана, составляет 192 ед./мЛ. Полученный препарат иммобилиэованной лвктатдегидрогеназы имеет уд.в, 2,5 г/см .ЬП р и м е р 11, 500 мг проназы расч воряют в 10 мл воды и этот раствор вводят при перемешивании в 40 мл 1% ного раствора агара, предварительно нагретого до Эф 95 С и охлажденного до 40 оС, В полученоный раствор добавляют при перемешивании опилки (уд.в. 7,8 г/см ) в количестве 182 г,э.что соответствует объемной дозе наполнителя 0,30. Полученную смесь выдерживают фф при 6-8 оС в течение 16 час. Для определения ферментативной активности 20 мг препарата иммобилизованной проназы суспендируют в 5 мл воды и выдер-: р живвют в течение 20 мин. Затем отбирают пробу объемом 0,1 мл и вводят ее в 10 мл 0,02 М раствора этилового эфира К -ацетил-Ь -тирозинв в 0,5 М трис-буфере срН 9 0 при температуре 30 оС За ходом ре акции гидролиэа этилового эфира Я -ацетил- - Ь -тироэина следят с помощью РН-статирования, поддерживая постоянное значение рН реакционной смеси путем титрования 0,05 и. едким натром. ЮЗа меру активности фермента принимают начальную скорость расхода титрантв. Активность препарата иммобилиэованной пронаэы составляет 38% от активности неиммобилиэоввнного фермента. Препарат имеет уд. в.3,0 г/см . 0 НИИПИ, Заказ 3576/318 П р и м е р 12. 500 мг цапаина растворяют в 10 мл воды, содержащей 0,01 моль/лцистеинхлорида и 2 ммоль/л трилона Б. Этотраствор вливают при перемешивании в 40 млФ8%-ного водного раствора клейстеризованного картофельного крахмала при 40 оС. В пслученный раствор вводят при перемешиваниипорошкообраэную окись алюминия (уд.в,3,8 г/см) в количестве 160 г, что соответствует объемной доле наполнителя 0,43.Полученную смесь выдерживают при 6-8 оСв течение 40 час,Для определения активности 50 мг препарата иммобилизованного папаина суспендируют в 10 мл воды, в которой содержится0,01 моль/л цистеинхлорида и 2 ммоль/лтрилона Б, и выдерживают в течение 10 мин.Затем отбирают пробу объемом 0,5 мл ивводят ее в 10 мл 0,02 М раствора этилового эфира К -бензоил-аргинина в 0,05М трио-буфере с рН 8,5 при температуре35 оС. За ходом реакции гидролиэв этилового эфира Ю -бензоил- Д -аргина следят спомощью рНстатирования, поддерживая постоянное значение РН реакционной смеси путем титрования 0,05 н, едким натром, Вкачестве меры активности фермента принимают начальную скорость расхода титрвнтв.Активность препарата иммобилиэованного папаина составляет 1 18% ог активности неим"мобилизованного фермента. Препарат имеетУд,в. 2,2 г/смв. формула изобретения 1. Способ получения препаратов иммобилизованных ферментов введением фермента в раствор гелеобразующих веществ с последующим переводом раствора в гель, о т - л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения эффективности препаратов путем использования их в псевдоожиженном слое, в раствор гелеобразующих веществ вводят мелкодисперсный инертный наполнитель.2. Способ по и. 1, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью получения препаратов иммобилизованных ферментов с заданным значением удельного веса, в качестве наполнителя используют химически инертные вещества с уд.в, 2,4-113 г/см, причем объЪемная доля наполнителя составляет 0,08-0,6.3, Способ по пп. 1 и 2, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве наполнителя используют химически инертное вещество, выбранное из группы, состоящей иэ окислов металлов, окислов неметаллов, мелкодисперсных металлов, силикатных материалов.