Способ получения комплекса протеолитических ферментов

.8)свидетельство СССР 12 Й 9/48, 1972, идетельство СССР 1211 1/20, 1970, идетельство СССР 14 С 1/06, 1965,о 2 ГОСУДАРСТВЕННЫИ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬТИЙ(54)(57) 1, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ фЕРМЕНТОВ из отходов производства стрептомиЯО 10 7206 цина, включаюший очистку исходного сырья от балластных белков, стрептомицина и солей, выделение целевого продукта и его сушку, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с цепью удешевления способа и повышения протеолитической активности ферментного комплекса, в качестве источника сырья используют сточные воды производства стрептомицина, которые упаривают в трех-пятикратном объеме, а очистку осуществляют путем введения хлористой соли кальция или магния в количестве 50- 55 г на 1 л упаренных сточных вод,2, Способ по и, 1, о т л и ч а ю - ш и й с я тем, что перед упариванием проводят дополнительную стабилизацию фер= ментного комплекса путем введения хлористой соли кальция или магния в количестве 0,2-4 г на 1 л сточных вод, 1027206Изобретение относится к ферментнойпромышленности, в частности к способамполучения протволитических ферментов измикробиологического сырья, в частностииз культуры ЯЕр 1 ое 1 СЕ 6 .5Известен способ получения протеолитичвских ферментов из отходов производствеитаконовой кислоты, а именно из мицелияплесневого грибе АрЕЯ 1 ИО 1 ГСОВЦНедостатком етого способа являетсянизкая активность получаемого препарата (6-9 вд/г).Известен способ получения комплексапротеолитических ферментов, продуцируемых ЬО.ер 1 огоусе р"ьЕов, включающий получение культуральной жидкости,очистку ве от стрептомицина изопропиловым спитром, выделение целевого продукта и его сушку 2.Недостатками данного способа являют-20ся относительно низкая протеолитическая активность перепарата (700 вд/гпрепарата по Кунитцу) и недостаточнаяочистка от стрептомицина 1 его содержание впрвпарате составляет 3,5%).25Известен также способ получения комплекса протеолитических ферментов (протеолитичвского препарата протелина) изотходов производства стрептомицина, включающий очистку исходного сырья от балластных белков, стрептомицина и солей,выделение целевого продукта и его сушку, согласно которому в качестве исход",ого сырья используют не непосредственно сточные воды, а отделенный от 35них мицелий, очистка от стрептомицинаи ч римесей осуществляется сорбцией накатионите с последующей хроматографиейи депигментацией Г 3Недостатками способа являются трудоемкость его осуществления, сложностьтехнологии, недостаточная активностьпротеолитического комплекса.Бель изобретения - удешевление спосооа и повышение протеолитичвской активности ферментного комплекса,Поставленная цель достигается твм, что согласно способу получения комплекса протеолитических ферментов из отходов производства стрептомицина, випо 50 чающему очистку исходного сырья отбалластных белков, стрептомицина и солей, выделение селевого продукта и его сушку, в качестве источника сырья используют сточные воды производства стрептомицхна, которые упаривают в трех-пятикратном объеме, а очистку осуществляют путем введения хлористой соли кальция или магния в количестве 50 55 г на 1 лупаренных сточных вод.При атом перед упариванием проводятдополнительную стабилизацию фврментного комплекса путем введения хлористойсоли кальция или магния в количестве0,2-4 г на 1 л сточных водПример 1.К 5 лсточныхвод,имеющих следующую характеристику:содержание белка 4,3 5,5 мг/мл; содержание стрептомицина 0,1 6,0 ед/мл; исходная протеолитическ ая активность ( поКунитцу) О 5-11,5 ед/мл; рН 4,5-6,0полученных после отделения стрептомицина, непосредственно перед упариваниемвводят СаС 1 6 НО в количестве 0,001 М.Затем раствор концентрируют на циркуляционном испарителе, который обеспечивает мягкое упариванив раствора до 1/5объема при остаточком давлении 1020 мм рт. ст. и температуре не выше40 оС в течение 2 ч. Концентрированныйраствор охлаждают до 4 сС, а затемвводят СаС 1 в концентрации 0,23 Мдо насыщения, Суспензию выдерживают10 ч. при 4С, Осадок отделяют полчасацентрифугированием при 8 тыс. об./мин.Надосадочную жидкость диализируют1-1,5 суток при температуре не выше10 С, а затем лиофильно сушат.Выход препарата - 0,05% (по расчетуна 100 л сырья).Активность фврментного комплекса2420 ед/г препарата при определениипротеолитической активности по методуК унитца,Получаемый комплекс содержит трипсин- и химотрипсинподобные протеиназы,а также амино- и карбоксипептидазы.Состав сточных вод непостоянен, подо-му предварительная стабилизация неявляется обязательной операцией.П р и м е р 2. Последовательностьопераций осуществляют в соответствиис методикой,описанной в примере 1,ВарыФуют количество вводимой всточные воды хлористой соли кальция:до управления для стабилизации в количестве 0,01 М, после упаривания дляочистки - 0,24 М,Упаривание осуществляют в трехкратном объеме.Выход препарата составляет 0,1%,Активность препарата по Кунитцу6220 ед/г.П р и м е р 3, Способ получения комп.лекса протволитических ферментов осуществляют в соответствии со схемой,1027206 Составитель Е. ВоробьеваРедактор О, Половка Техред Т,Маточка Корректор Г. Огар Заказ 4672/28 Тираж 523 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская набд, 4/5 филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 описанной в примере 1, однако в качестве хлористой сопи берут МС 3 в количестве: до упаривания 0,02 М, после упаривания - 0,25 М,Выход препарата составляет 0,1%,5Активность препарата по Кунитцу7000 ед/г. Уменьшение количества (менее 0,001 М хлористой соли приводит к снижению активности препарата до 42% при упаривании, а повышение концентрации более 0,02 М - к увеличению времени упаривания раствора и инактивации ферментно - го комплекса; снижение концентраций 5 (менее 0,23 М) СаС 1 или МСВ приводит к недостаточной очистке раствора от балластных белков, а увеличение концентрации соли (более 0,25 М) - к потерям активности за счет осаждения части 20 ферм ентного комплекса. По своему составу препарат представляет собой комплекс энцо- и экэопептигидролаз включакюцих химотрипсин,трипсин, нейтральные прссгеинаэы, карбо,ксипептидазы, амннопептидаэы.Использование предлагаемого способаобеспечивает по сравнению с известнымиследующие преимущества: получение фер,ментного протеолитического комплекса с высокой активность (до 7000 ед/г препарата по Кунитцу); достижение хорошейочистки препарата; удешевление способаза счет утилизации сточных вод производства стрептомицина; стоимость которых 2 руб. за 1 м , простоту и доступ-,ность средств для осуществления предлагаемого способа. Таким образом, изобретение позволяетудешевить способ и повысить активностьпротеолитического комплекса.