Способ получения биологически активного комплекса

. Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам ТЕНИк2Ж (21) 4788528/05 (22) 06.02.92 (57) Использование: в медицине в качест- (46) 27.05.96 Бюл,15 вс протсолитически активного агента, Сущ- (72) Гафарова М.В., Иванова Г,П., Тарати- ность изобретения: в качестве на Т.М Савельева Н.В., Фатеева Л.И., высокомолекулярного соединения при полАфиногенов Г.Е., Полях М.С., Панарин учении биологически активного комплекса Е.Ф., Москвичев Б.В.используют соль сополимера винилпирроли- (71) Всесоюзный научно-исследовательский дона с хротоновой кислотой и основания технологический институт антибиотиков и димстилбснзилалкиламмония, а взаямодсйферментов медицинского назначения ствис тсррилитина с высокомолекулярным (56) Авторское свидетельство СССР Х соединением проводят при рН среды 6,0 - О 518953, кл. С 08 Р 8/32, 1975. Террилитин. 8,0 и массовом соотношении общего олиФармакопейная статья М 42-2245-84, 1984, чсства террилитина и соли сополимера, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕ- равном 1: 8 - 1; 12, при удельной про- СКИ АКТИВНОГО КОМПЛЕКСА теолитической активности террилитина неменее 25 ПЕ/мг белка, 1 табл.Изобретение относится к химии высокомолекулярных соединений, а именно к получению полимерных соединений, обладающих биологической активностью, которые могут найти применение в медицине. В медицинской практике, например, при лечении ран, ожогов, гнойных и воспалительныхзаболеваний необходимо проводить лечение препаратами, обладающими одновременно антимикробным и протеолитическим 10действием. По источникам научно-технической информации и патентной документации.не выявлены способы получения такихпрепаратов.Известен способ получения водорастворимых физиологически активных полимерныхсолей путем взаимодействия сополимероввинилпирролидона и непредельных кислотс четвертичными аммониевыми основаниями. Полученная полимерная соль обеспечивает широкий спектр противомикробногодействия.Известны ферменты микробного происхождения, обладающие протеолитическимдействием, которые могут быть испольэованы в медицине, В лечебной практике исполь-.зуются водные растворы этих ферментов,например террилитин, при этом специфическая вктивйость его в таких условиях сохраняется очень непродолжительное время 30Специфическая активность раствора нативного твррилитина при хранении в холодильнике сохраняется в течение 0,5-1 мес.Целью изобретения является увеличение стабильности протеолитической активности целевого продукта.Поставленная цель достигается в способе получения биологически активногс комплекса, включающем взаимодействие прикомнатной температуре в водном растворе 40террилитина с высокомолекулярным соединением, тем, что в качестве высокомолекулярного соединения используют соль сополимеров винилпирролидона с кротоновойкислотой и основания диметилбензилалкиламмония, а взаимодействие террилитина свысокомолекулярным соединением проводят при рН среды 6,0-8,0 и массовом соотношении общего количества террилитина исоли сополимера, равном 1:8-1;12, при удельной протеолитической активности террилити-,на не менее 25 ПЕ/мг белка,Условия образования биологически активного комплекса определяются. природойфермента, его концентрацией, а также такими параметрами реакционной среды, какрН, присутствием неорганических солей ит.д.Образование биологически активногокомплекса по изобретению происходит в результате электростатического взаимодействия между противоположно заряженными функциональными группами фермента и полимерной соли, т.е, с одной стороны происходит усиление гидрофобных взаимодействий внутри глобулы белка, приводящее к стабилизации нативной структуры, с другой стороны - создаваемое гибкоцепным многозарядным полимером микроокружение препятствует агрегации молекул фермента, тем самым предотвращая явление автолиза, приводящее к потере активности. Одновременно антисептические свойства полимерной соли предотвращают бактериальное заражение раствора, содержащего фермент, Биологически активный комплекс по изобретению сохраняет протеолитическую активность длительное время (12 месяцев) находясь в водном растворе, в отличие от известных комплексов (см. таблицу),П р и м е р 1. 250 мл раствора полимерной соли сополимера винилпирролидона с кротоновой кислотой и основания диметилбензилалкиламмония с концентрацией пол-имерной соли 16 мг/мл в 0,1 М растворе йаС смешивают с 250 мл рабочего раствора террилитина. Рабочий раствор террилитина готовят из водного концентрата террилитина концентрации 2,9 мг белка/мл с активностью 80 ПЕ/мл, сливая 175 мл концентрата террилитина с 75 мл дистиллированной воды. При этом в реакционной смеси общим объемом 500 мл реализуются условия взаимодействия по концентрации реагирующих компонентов: полимерной соли 8 мг/мл, террилитин 1 мг белка/мл, следовательно, массовое соотношение террилитин (по белку): полимерная соль равно 1;8 при удельной активности фермента 25 ПЕ/мг белка,Полученную реакционную смесь перемешивают при комнатной температурЕ в течение 15-20 мин при рН 6,0. При отклонении значения рН от заявляемого интервала, которое может произойти в результате взаимодействия компонентов, реакционную смесь подтитровывают 2-3 каплями концентрированното раствора едкого натра или соляной кислоты соответственно. Процесс ведут при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке. Биологически активный комплекс выделяют лиофильно. Полученный биологически активный комплекс хорошо растворим в воде, обладает высокой протеолитической активностью и антимикробными свойствами, эффективен в отношении штаммов микроорганизмов, устойчивых к действию антибиотиков. Выход по,протеолитической активности составляет 907 ь,5 10 15 20 3035 40 50 55 П р и м е р 2. Как в примере 1,250 млраствора полимерной соли концентрации.24 мг/мл в 0,1 М растворе НаС смешиваютс 250 мл рабочего раствора террилитина,полученного из концентрата фермента, содержащего 2,9 мг белка/мл с активностью100 ПЕ/мл, рН реакционной среды 8,0. Приэтом реализуются следующие условия получения биологически активного комплексамассовое соотношение фермент (по белку)полимерная соль 1:12, удельная активностьтеррилитина 35 ПЕ/мг белка. Лиофильновысушенный целевой продукт - биологически активный комплекс имеет выход по протеолитической активности 96, Весь белокв комплексе связан с полимерной солью.П р и м е р 3, Как в примере 1,250 млраствора полимерной соли концентрации.10 мг/мл в 0,1 М растворе йаС смешиваютс 250 мл рабочего раствора фермента,полученного из концентрата террилитина сконцентрацией 2,9 мг белка/мл и активностью 100 ПЕ/мл. При этом реализуются следующие условия: массовое соотношениефермент (по белку) полимерная соль 1;5,удельная активность террилитина 35 ПЕ/мгбелка. Протеолитическая активность лиофильно высушенного комплекса составляет957 ь от исходной. Результат гель-хроматог, рафии показал, что только небольшая частьактивного белка (15) связана в высокомолекулярный комплекс, При этом полученный препарат не проявляет необходимоеантимикробное действие. Тест на обсемененность препарата показал наличие мик. рофлоры до 1000 КОЕ/мл.П р и м е р.4. Как в примере 1, 250 млраствора полимерной соли концентрации40 мг/мл в 0,1 м растворе МаС смешиваютс 250 мл рабочего раствора фермента, полученного из концентрата террилитйна, содержащего 2,9 мг белка/мг с активностью100 ПЕ/мл при рН среды 7,0, При этом реализуются следующие условия массовое со: отношение фермент (по белку): полимернаясоль 1:20, удельная активность 35 ПЕ/мг: белка.Протеолитическая активность высушенного комплекса составляет 50 от исходной,П р и м е р 5. Получение биологическиактивного комплекса проводят, как описаноа примере 1 за исключением того, что раствор полимерной соли берут в концентрацйй 20 мг/мл, а взаимодействие происходитв 0,05 М фосфатном буфере, рН 5,0.При этом реализуются следующие условия: массовое соотношение фермент (по белку): полимерная соль 1;10 при удельной активности террилитина 25 ПЕ/мг белка, Протеолитическая активность лиофильно высушенного комплекса составляет ЗО от исходной активности фермента.П ри м е р 6. Получение биологически активного комплекса проводят, как описано в примере 2, за исключением того, что взаимодействие террилитина с полимерной цолью происходит в 0,1 М содовом буферном растворе, рН 9,0. При этом реализуются условия - массовое соотношение фермент (по белку): полимерная соль 1;12, удельная активность террилитина 35 ПЕ/мг белка, В этих условиях происходит образование высокомолекулярного комплекса с протеолитической активностью 25 от исходной активности фермента.П р и м е р 7. Биологически активный комплекс получают аналогично описанному способу по примеру 1, Берется 250 мл раствора полимерной соли концентрации 24 мг/мл в 0,1 М растворе чаС и смешивается с 250 мл рабочего раствора фермента,полученного иэ концентратора террилитийа, содержащего 2,9 мг белка/мг с активностью 45 ПЕ/мл, рН среды 7,0. При этом реализуются следующие условия получения биологически активного комплекса: массовое соотношение фермент (по белку): полимерная соль 1:12, удельная активность террилитина 15 ПЕ/мг белка, Протеолитическая активность высушенного лиофильно комплекса составляет 95 от исходной активности фермента или 1,0 ПЕ/мг, что недостаточно для создания лечебного действия.П р и м.е р 8. Биологически активный комплекс получают аналогично описанному способу по примеру 1. Берут 250 мл раствора полимерной соли концентрации 20 мг/млв 0,1 М растворе МаС, смешивают с 250 мл рабочего раствора террилитина, содержащего 2 мг белка/мл с активностью 90 П Е/мл. Рабочий раствор террилитина готовят,45 растворяя 500 мг высокоочищенного лиофильно высушенного фермента в 250 мл дистиллированной воды. При этом реализуются следующие условия взаимодействия по концентрации реагирующих компонейтов: полимерной соли 10 мг/мл, террилитина 1 мг белка/мл, следовательно, массовое соотношение террилитин (по белку): полимерная соль 1:10 при удельной активности фермента 45 ПЕ/мг белка. При иоведенйи реакции взаимодействия наблюдается потеря активности фермента. ПротеолитичеСкая активность высушенного комплекса составляет 30 от исходной,1795643 Через 1 год хранения образцов в растворе Условия взаимодействияПримечание Протеоли- Протеолитическая тическаясохранения акрН Массовое соотноще" тивности,Аг х 100 активактивность, А г,ка: ка 1:8 ламмония То же, Компонентныйсостав Террилитин + полимерная соль сополимерэ Й-вйнилпиролидо- на с кротоновой кислотой и диме- тилбензилалкиТеррилитин +диметилбензилалкиламмония хларид Террилитин + сополимер М-винилпиролидона с кротоновой кислотойТеррилитин +сополимер М-винилпиролидона с акролеином Террилитин + де- кстран-полиглюТеррилитин + полимерная соль сополимера ние фермент (по белку): п,ол имер6,08,0 7,0 Послереакциивзаимо- действия ность, Ао,ПЕ/мг бел 28,5 .33,6 29,4 ПЕ/мг бел 28,9 33,5 30,01795643 Продолжение таблицы Через 1 год хранения ПримечаПослереакции взаимод- ействияя Условия взаимодействиянтный образцов в растворе авсохранения активности, Ат х 100 ф Протеолитическаяактивность, Ак, ПЕ/мг белМассовое соотношеПротеолитическая активность, Ао,ПЕ/мг бел ние фермент по белку): ка полимер ка ролидооновой елк 5,0.террилит ходная ктивно П р и м е ч а н и е. Протеолитическая активность олрелекулярного субстрата каэеина. Относительная погхранились в холодильнике при 4-10 С. лялась по гидролизу высокомошность метода 106. Растворы ния ИЧЕкулярного соединения исп сополимера винилпирролид новой кислотой и основа бензилалкиламмония, а взб террилитина с высокомолек динением проводят при рН 8,0 и массовом соотнош количества террилитина и мера, равном 1; 810 удельной протеолитическо террилитина не менее 25 Корректор С,Патрушева тавитель И; Стояченкоред М.Моргентал дакто каз 300 Тирам Подписное НПО "Поиск" Роспатента13035, Москва, Ж, Раушская наб,. 4/5 зводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ум л.Гагарина, 101 Формула изобретеСПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГ СКИ АКТИВНОГО КОМПЛЕКСАСпособ получения биологически ак:тивного комплекса, включающий взаимодействие при комнатной температуре в водном растворе террилитина с высокомолекулярным соединением, отеегю. щийся тем, что, с целью увеличения стабильности протеолитической активно,сти комплекса, в качестве высокомолеользуют соль и на с крото" ния диметилаимодействие улярным соесреды 6,0- енин . общего соли сополи: 12, приактивности ПЕ/мг белка.