Способ получения эндонуклеаз-рестриктаз, обладающих способностью узнавать и расщеплять последовательности нуклеотидов 5 -gpucgpyc-3 и 5 -catg-3

(19) (1 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТ ЙРи Гкнт сссРОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ У ДЕ 1 П:Л Н АатоескоМУ НаеворМ 1 цв 1 пз ЦНИИ вакцинМечникова и хр й коллекции пр низмов институ од номером ВИ Штамполуче Е 1 цепгае и сыворотанится во омьппленны та "ВНИИ1 М В. м. И.И.сесоюзно упрошение микроорг етика"(71) Научно-производственное объединение "Фермент" и Центральный научноисследовательский институт вакцин исывороток им. И.И. Мечникова(5 б) 11 ЬдсеЬеай Р.К. апй Вгоып 0.1,.А, з 1 вр 1 е апй горЫ веСЬой аког гее-п 1 пр. Ьасйегда Йог гуре 1 гезгг 1 с 1 оп епйопцс 1 еавея епгувея 1 п АрЬапогЬесе Ьа 1 ор 18 г 1 са.-АгсЬ. М 1 сгоЬхо 1., 1985, ч. 141, Н 1, р. 70-75.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДОНУКЛЕАЗРЕСТРИКТАЗ, ОБЛАДАЮЦИХ СПОСОБНОСТЬЮУЗНАВАТЬ И РАСЦЕПЛЯТЬ, ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ НУКЛЕОТИДОВ 5,-СРцСОРуСи5 -САТО1Изобретение относится к микробиологической промышленности, к пр иэводству ферментов, в частности к способу получения рестриктаз.Целью изобретения является щение способа получения и повь выхода целевых продуктов.(57) Изобретение относится к микро- . биологической промьппленности, к способам получения фермента, специфически расщепляющего ДНК. Рестриктазы могут быть использованы для исслеДования первичной структуры ДНК и в , генной инженерии. Цель изобретения -1упрощение способа получения и повышение выхода целевых продуктов. Способ заключается в том, что в качестве продуцента рестриктаз используют штамм НаеворЬ 11 цз дпй 1 цепгае КРЬ 1 (ВИ 1 М В). Культивирование прово. дят в условиях аэрации на питательной среде до достижения .оптической плотности суспензии клеток 1,8-2,5 о.е. Клетки разрушают ультразвуком, центрифугируют и проводят очистку ферментов из полученного бесклеточного экстракта путем хрбматографин на фосфоцеллюлозе с последующей очисткой рестриктазы Н 1 п 11 на голубой сефарозе и гепаринсефарозе и хроматографической очисткой рестриктазы Н 1 п 111 на ДЭАЭ-целлюлозе и гепаринсефарозе. При использовании способа получают высокие выходы высокоочищенных рестриктаз Н 1 п 11 и Н 1 п 111 (15000 и 1000 ед/г биомассы соответственно).пособ осуществл сл едующим образом.Пример 1. П таэ Н 1 п1 и Нхп 1 1 цз 1 пй 1 цепгае КР 1. олучение рестри 11 .из Наешорй 111 оследовател ьнос 1, Культивирова чение биомассы. 11. Выделение итаз: 1. Разрушение к 2. Хроматография ть операций.ие штамма и полустка рест токна фосфоцеллюлоз 3. ) . Очистка рестриктазы Нп 13,1,1. Фракционирование белковголубой сефарозе.3.1.2. Хроматография на гсефарозе.3,2, Очистка рестрикт3.2,1. Хроматографиялюлозе,3.2, 2. Хроматография на гепаринсефарозе,1, Для получения биомассы НаепорЫ 1 цз 1 пГ 1 цепгае КР 1 1 используютаппаратуру; лабораторный ферментер"Биолафит" (Франция), рН-метр, термостат, автоклав, круговые качалки,спектрофотометр СФб, проточнаяцентрифуга типа "ЦЕПА" (ФРГ), боксламинарный.Для размножения и культивирования штамма используют сердечно-мозговой экстракт (Вга 1 п Неаг 1 п 1 цз 1 оп"Р 1 йсо",с добавлением Х и У факторовПитательная среда в своем составе на епариназы Н 1 п 1 11:на ДЗАЭ-целИспользуемыи штамм НаешорМ 1 цз дпй 1 цепгае КР 1. 1 обладает следующимиорфологическими, культуральными и физиологическими признаками. Клетки коккобациллярные, Грамотрицательные, неподвижные, бескапсульные; требует дЛя роста Х и У факторов; на плотных средах формируют прозрачные мелкие колонии; гемолиэ отсутствует. Штамм образует уреазу, расщепляет ксилозу; образует индол, не имеет р-галактозидаэы и не утилизирует орнитин (относится к второму биотипу по К 1111 ап),На агаризованном экстракте мозга и сердца теленка после 24 ч инкубации в термостате при 370 С образует мелкие, круглые с ровными краями колонии. Колонии гладкие, блестящие, с агаром не срастаютс. В мясо-пептонном бульоне культура не размножается. Оптимальная температура роста 370 С40 ссреда. Инокулят выращивают на тер 5 10 15 20 25 30 Э 5 содержит 3,7% экстракта мозга и сердца теленка, 0,02% никотинамидадениндинуклеотида (НАД) и 0,1% гемина,рН 7,0. Сердечно-мозговой экстрактстерилизуют при 1 атм в течение20 мин, раствор гемина - при 70 Св течение часа, раствор НАД - ультрафильтрацией,Штамм Н. хпй 1 цепгае КР 1. 1 поддерживают в лиофильно высушенном видепри +4 С. Криозащитную среду дляхранения культуры готовят отдельноследующим образом: раствор сахарозыи желатины стерилизуют,при 0,9 атмв течение 30 мин два раза черезсутки и перед приготовлением бактериальной суспенэии в так приготовленный, стерильный раствор в асептических условиях добавляют такое жеколичество бычьей сыворотки.Для оживления культуры в две пробирки с питательной средой (сердечно-мозговой экстракт, НАД и гемин)и две пробирки с мясо-пептоннымбульоном (для контроля чистоты культуры) переносят лиофильно высушенную культуру, Пробирки инкубируют18 ч при 37 С, затем бактериологической петлей культуру повторно пересевают в две пробирки с питательной средой и мясо-пептонным бульономи помещают на круговые качалки при80-100 об/мин. Через 8-20 ч культивирования проводят третий пассаж -для непосредственного засева ферментера: по 0,25-0,30 мл таким образомполученной суспензии клеток добавляют в две колбы с О, 25 л в каждой мостатированных круговых качалках при 200 об/мин, 37 С в течение 18- 20 ч, Оптическая плотность суспенэии инокулята при длине волны 540 нм составляет 3,0-3,5 о.е. Полученный инокулят засевают в лабораторный ферментер "Биолафит", содержащий 1 О л питательной средь. Культуру Н. 1 п 21 цепгае КРЕ 1 выращивают при 37 С, рН 7,0-7,2 со скоростью перемешивания в первый час культивирования 150 об/мин и далее до 250 об/мин а также подачей стерильного воздуха 3 л/мин в первый час роста кльтуры с постепенным увеличением до 5 л/мин на б-м часу роста, Заданную рН во время выращивания культуры под" держивают добавлением насыщенного, раствора бикарбоната натрия58388 б За условную единицу активностипринимается то количество фермента,которое в оптимальных условиях за 51 ч полностью расщепляет 1 мкг ДНКфага лямбда.Все операций но выделению и очистке фермента проводят при +4 С.1 Разрушение клеток. 30 г био- О массы, полученнои при культивировании Н. жй 1 пепгае ВХЬ 1 суспенго 0,1 И БаС 1, обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе УЗДНТ в 15 течение 15 мин и центрифугируют при20000 об/мн на центрифуге Бекман ЖЦ, ротор ЖА,2. Хроматография на фосфоцеллюлозе, Полученный бесклеточный экстракт 20 со скоростью 30 мл/ч наносят на ко 30 5 14Во время культивирования периоди"чески отбирают пробы и измеряют оптическую плотность суспензии клеток;Культивирование штамма проводят допоздней логарифмической фазы роста -оптическая плотность суспензии клетоксоставляет 1,8-2,5 о.е. (длина волнЫ540 нм).Культуральную жидкость охлаждаютдо +4 С и центрифугируют на проточнойцентрифуге типа ЦЕПА при 2,5 10 об//мин. Полученную биомассу хранят при-20 С. Выход сырой биомассы 2,5- ,.3,5 г/л культуральной жидкости.11. Для выделения и очистки рестриктаз используют следующую аппаратуру: ультразвуковой дезинтеграторУЗДНТ, центрифугу Бекман Ж 21 Ц, холодильную камеру "Миниколдлаб", хроматографические колонки, термостат,аппарат для электрофореза, универсальный источник питания.ДНК фага лямбда выделена по известной методике (Яа 1 о Н., Мыга 2К,1. В 3,осЬеш, ВхорЬув Аса, 1963,72, 619-629).При разрушении клеток и хроматографии используют буферный раствор(В): 10 мМ калийфосфатный буфер рН7,4, содержащий 10 мМ 2-меркаптоэтанола,дируют в 100 мл буфера В, содержащелонку размером 2,515 см с фосфоцеллюлозой, уравновешенной буфером В, содержащим 0,1 М ИаС 1. Колонку промывают 150 мл того же буфераи элюируют линейным градиентом ИаС 1 от 0,1 до 1,0 М в 500 мл буфера В. Отдельно собирают фракции, элюируемые при 0,25-0,36 М НаС 1, содержащиеосновную часть активности рестриктазы Нхп 1 1, и фракции, элюируемыепри 0,58-0,7 М, содержащие активностьрестриктазы Н 1.п 1 11. Далее очисткурестриктаз Нп 1 1 и Нп 1 11 провоАктивность рестриктаз тестируют методом гидролиза ДНК фага лямбда с последующим . разделением полученных фрагментов электрофорезом в агарозном геле. Реакционная смесь для гидролиза ДНК фага лямбда рестриктазой Ндп 1 1 содержит 10 мМ трис-НС 1 рН 8,5, 25 мМ НаС 1, 5 мМ МяС 1 100 мкг/мл альбумина бычьей сыворотки, 2 мкг ДНК фага лямбда в 40 мкл смеси и 5 мкл фермента. Реакцию проводят при 37 ОС 5 мин. Реакционная смесь для гидролиза ДНК фага лямбда рестриктазой Нп. 11 содержит 10 мМ трис-НС 1 рН 8,5, 50 мМ НаС 1 10 мМ МяС 1, 100 мкг/мл альбумина бычьей сыворотки, 2 мкг ДНК фага лямбда в 40 мкл смеси и 5 мкл фермента.Реакцию проводят при 37 С 10 мин.оЭлектрофорез проводят в 0,1 М натрийборатном буфере рН 8, 2, 2 мМ ЭДТА в течение 2 ч при напряжении 100 В и силе тока 100 мА. Окрашенные этидийбромидом ( мкг/мл) гели просматривают в Уф-свете. 35 40 45 50 55 дят отдельно,3.1. Очистка рестриктазы Н 1 п 1 1.3,1.1. Фракционирование белков наголубои сефарозе.Фракции, содержащие активностьрестриктазы Нп 1 1, объединяют идиализируют в течение 16 ч противбуфера В, содержащего 0,2 М НаС 1.Ферментный раствор после диализа соскоростью 20 мл/ч наносят на колонку размером 1,5 АЙ 0 см с голубой сефарозой, уравновешенной буфером В, содержащим 0,2 М 11 аС 1, и промывают60 мл того же буфера. Собирают элюрт, содержащий основную часть рестриктазной активности (фракции 1).3.1.2. Хроматография на гепаринсефарозе.фракцию 1 со скоростью 20 мл/чнаносят на колонку размером 1,5 7 смс гепаринсефарозой, уравновешеннойбуфером В, содержащим 0,2 М ХаС 1,промывают тем же буфером (30 мл) и элюируют линейным градиентом концентрации БаС 1 от 0,2 до 0,6 М в240 мл буфера В, Фракции, элюируемыесия 3.2.2. Хро инСефарозе,Фракцию 1 со скоростью 20 мл/ч найосят на колонку размером 1,5 хб смС гепаринсефарозой, уравновешеннойбуфером В, содержащим 0,1 М 1 аС 1,промывают 30 мл того же буфера излюируют линейным градиентом конценТрации ИаС 1 от 0,1 до 1,0 М в 120 млбуфера В, Фракции, элюируемые приО,Ь 8-0,8 М ИаС 1, объединяют и ферМентныи препарат концентрируют путемциализа против буфера В, содержащего0,1 М ЫаС 1, 0,1 мМ ЭДТА и 502 глицерина (по объему). Ферментный препарат хранят при -20 С, Из одного грамма биомассы йолучают 1000 единиц активности рестриктазы Н 1.п 1 11.Определение последовательностейнуклеотидов, узнаваемых рестриктазами Нхп1 и Н.п 1 11.Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Н 1.п 1 1, использовали ДНК фагалямбда. Проведено расщепление этойДНК рестриктазой Н 1.п 1 1, рестриктазой А Ьа 11 (которая узнает н расщепляет последовательность нуклеотидол 5 -СРпССРуС) и совместно матография на. гепар/ 14 Ори 0,3-0,4 М ИаС 1, объединяют и ферМентный препарат концентрируют путем диализа против буфера В, содержащего О, М НаС 1, 0,1 мМ ЭДТА и 50/ глиЦерина (по объему). Ферментный прег(арат хранят при -20 С, Из одного грамма биомассы получают 15000 еди иц активности рестриктазы Нп 1 1. 3.2. Очистка рестриктазы Ны 1 11. 3.2.1, Хроматография на ДЭАЭ-цел,(юлозе.Фракции, содержащие активность естриктазы Ндп 1 11, объединяют и иализируют в течение 16 ч против уфера В. После диализа раствор фер(мента центрифугируют при 20000 об/мина центрифуге Бекман 7(-21 Ц, ротор -20.11 олученный супернатант со скоросью 20 мл/ч наносят на колонку размеом 1,5 15 см с ДЭАЭ-целлюлозой, равновешенной буфером В промывают . тим же буфером (80 мл) и элюируютнейным градиентом БаС 1 от 0,0 до,5 М в 280 мл буфера В, Фракции, .люируемые при 0,04-0,12 М БаС 1, фбъединяют; они содержат. основную часть рестриктазной активности (фракэтими рестриктаэами. Во всех случаяхэлектрофореграммы совпадают с элект-.рофореграммой, полученной после обработки ДНК фага лямбда только. рестриктазой Ндп 1 1. Это указывает нато, что эти рестриктазы являютсяизошизомерами, т.е. расщепляют последовательность нуклеотидов 5-СРцССРуС,10 Для подтверждения узнаваемойпоследовательности нуклеотидов и определения места расщепления проводили частичный гидролиз 5 - Р мечен.31ных Н 1.п 1 1 фрагментов ДНК рВК 322.1 б Двухмерное разделение полученногогидролизата электрофорезом на ацетилцеллюлозе и гомохроматографией в тонком слое ДЭАЭ-целлюлозы привело кфингерпринту, из которого выявлено,20 что гомологичной последовательностьюв участке расщепления явчяются тетрануклеотиды 5 -СС(Т/С)С. Следовательно, рестриктаза Нп 1 1 рас-.щепляет узнаваемый участок между25 вторым и третьим основаниями, образуя фрагменты с 5-выступающимилипкими концами:5-СРцССРуС 3-СРуССРпС,30 Для определения последовательностинуклеотидов, узнаваемой рестриктазойН 1 п 1 11, использовали ДНК фаговф 174, Кй и плазмиды рВК 322 с известнои первичной структурой, Их образ батывали рестриктазой Нп 1 11 и полученные данные о числе и длине фрагментов сравнивали с табличными(РпсЬз С. ес а 1 Сепе(1978), 4, 1-23;ГцсЬз С, е 1 а 1 Сепе, 980, 10, 35740 370). Сравнение этих результатов позволило обнаружить, что последовательность нуклеотидов 5-САТС узнаваемаярестриктазой И 1 а 111, имеет такую жечастоту встречаемости на использован 45 ных субстратах, как и Нп 1 11. Изэтого делали предположение, что рестриктаза Нп 1 11 обладает идентичнойсубстратной специфичностью с рестриктазой Н 1 а 111. Окончательное подтверб 0 ждение специфичности исследуемойрестриктазы было получено после определения места расщепления субстрата, Для этого использовали самокомплементарныи синтетический декадвзоксинуклеотид, содержащий участок, узнаваемый исследуемым ферментом: 5,-ССС САПС ССС;3 -ССС СТААСССС,9 14583После введения 5 -Р - концевой метки двухспиральный субстрат обрабатывали рестриктазой Ндп 1 11 и меченные продукты рестриктазной реакции анализировали в тонком слое ДЭАЗ- целлюлозы. В параллельной дорожке анализировали частичный 3 -экзонуклеаэный гидролизат этого же меченно-. го декануклеотида, входящего в сос- щ тав исследуемого дуплекса. Единственным меченным. продуктом расщепления оказался гептануклеотид 5 -з рССССАТС, Полученные результаты свидетельствуют, что рестриктаза Н 1 п 1 11 расщеп б ляет субстрат 5 -САТО;3 -СТАС,фв местах, указанных стрелками. 20 Составитель И. Ходарев Редактор А, Лежнина Техред М,Дидык Корректор М, ДемчикЗаказ 326/29 Тираж 500 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГЕНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Формула иэ о бр е тенияСпособ получения эндонуклеаз-рестриктаз, обладающих способностью уз навать и расщеплять последователь.ности нуклеотидов 5-СРцССРУСи 5-САТС,включающий культивирование продуцента до достижения заданной плотности клеток на жидкой пи тательной среде, содержащей сердечномозговои экстракт и факторы биосинте" 10за фермента, разрушение клеток ульт развуком и последующее получение це" левого продукта с использованием хроматографической очистки на фосфоцеллюлозе в калийфосфатном буфере и элюции ферментов градиентрм хлорис,того натрия, о т л и ч а ю щ и й - с я тем, что, с целью упрощения способа получения и повышения выхода целевых продуктов, в качестве продуцента используют штамм Наепар 1 п 1 цз 1 пЕ 1 иепвае ВКПМ В, послехроматографической очистки рестриктаз, разделяющихся на фосфоцеллюлозе, осуществляют дополнительную очистку для рестриктаэы, узнающей и расщепляющей1 последовательность нуклеотидов 5 - -СРцССРУС, путем хроматографии на голубой сефарозе и гепаринсефарозе с элюцией фермента буфером, содержащим 0,2 М ЯаС 1, при хроматографии на голубой сефарозе и градиентом БаС 1 0,2-0,6 М при хроматографии на гепаринсефарозе, а хроматографическую очистку рестриктаэы, узнающей . и расщеплякицей последовательность нуклеотидов 5 -САТСс 3, осуществляют на ДЭАЭ-целлюлозе и гепаринсефарозе с элюцией фермента градиентом ИаС 1 0,0-0,5 М и 0,1-1,0 М МаС 1 соответственно.