3, 5-диметил-2, 6-дифенил-4-(фенилэтинил)-пирилий перхлорат как реагент для определения метициллина

, 124 8 9/34, А 6 35 ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ,г1 ОБРЕТЕНИЯЕЛЬСТВУ ПИСАН НИЛ( ФЕРАТ КАК МЕТИЦИЛЛИНА нил(ферат формулы(57) 3,5нилэтини ДИМЕТИЛ, 6-ДИФ ИРИЛИИ ПЕРХЛ ОПРЕДЕЛЕНЫ етил,6-диф ирилий перхл следоваологии, Ростовск Знамени С 10 ЧернавсП. Шепеле ян к реагент антибиоти 025-1026,Мф: Мир ина. Р,4 РЗ О,У ВТОРСНОМУ СВИ(71) Ростовский научно-ительский институт .эпидеммикробиологии и гигиеныордена Трудового Красноггосударственный университим. М. А. Суслова./3,5-диметил,6-дифенил-фенилэтинил)-пирилий перхлорату (1), которыйможет быть использован как реагентдля определения метициллина в Фармакологии и медицине,Целью изобретения является выявление в ряду производных 4-фенилэтинилпирилия нового свойства - аналитического реагента для количественного колориметрического определения метициллина в растворе в смЕси с другимиантибиотиками без предварительногоотделения последних.П р и м е р 1. Получение перхлората 3,5-диметил,6-дифенил(фенилэтинил)-пирилия,Металлируют 2,0 г (0,02 моль) Фенилацетилена бутиллитием в абсолютном эфире в атмосфере инертного газапри 34-35 С в течение 1,5 ч. К образовавшемуся Фенилацетилениду литиядобавляют 3,61 г (0,01 моль) перхлората 2,6-дифенил,5-диметилпирилия.Перемешивают при кипячении 5 мин дополного растворения добавленногоперхлората. Реакционную смесь обрабатывают насьпценным раствором хлорида аммония, эфирный слой отделяют,сушат безводным сульфатом натрия иприбавляют 0,03 миль ацетилперхлората,Выход перхлората 3,5-диметил,6 дифенил(фенилэтинил)-пирилия 6065% (3 г), Т. пл. 189-190 С. ИК-спектр в вазелиновом масле, см : 2210 (С=С), 1610, 1590, 1570(ароматич.), 1100 (С.ЯО ).ПМР-спектр в трифторуксусной кислоте, внутренний эталон ГМДС, 6млнд.: 2,45 (с, 6 Н, 2 СН ); 7-7,65 (м, 15 Н, ароматические протоны).Найдено, % С 69,99;,Н 4,77; С 1 7,57 С, Н,СО,Вычислено, Х: С 70, 35; Н 4,59;С.1. 7,69.Соединениеплохо растворяется.в неполярных и малополярных растворителях и воде и хорошо - в полярных (спиртах, хлорорганических производных и диметилсульфоксиде),Перхлорат 2,6-дифенил,5-диметил-Фенилэтинил)-пирилия наиболее устойчив в хлороформе (окраскараствора сохраняется без измененияболее 4 ч, в спиртах и хлороргани 5 О 5 20 25 30 35 40 45 50 55 ческих растворителях, исключая хлороформ, зеленеет или буреет).П р и м е р 2. Методика определения метициллина в растворах неиз-,вестной концентрации.К раствору навески метициллинав 9 б -ном этаноле (объем пробы 5 мл)приливают 3,0 мл 0,05 -ного хлороформного раствора соединения 1ин;енсивно перемешивают и добавляют 0,5 мл 1 н. соляной кислоты. После встряхивания пробу оставляют на1-2 ч для развития окраски, Под водным слоем окраска спиртохлороформной фазы устойчива свыше 3 сут насвету, без воды - более 5 ч, Дляколориметрического определения спиртохлороформную Фазу отделяют и сни-. мают экстинкцию (Е) на фотоэлектроколориметре ФЗКМ со светофильтром 9 5 или более точно на спектрофотометре СФпри длине волны530 нм. Концентрацию метициллина опрецеляют по калибровочной кривой, построение которой описано в примере 3.Можно проводить определение и вводном растворе метициллина. Дляэтого берут 0,1 мл водного растворанеизвестной концентрации, доводят объем пробы до 5 мл 96 -ным этанолом и обрабатывают пробу, как описано выше.А, Взята навеска порошка, содержащего метициллинмассой 6,30 мг. Е, =0,312, Е =0,302, Е=0,307, чтосоответствует по калибровочной криьой 6 мг.Чистота препарата 95,2 ,.Б . Взят 0,1 мл исходного водного раствора метициллина неизвестной концентрации. Объем доведен до 5 мат96 -ным этанолом. Е=0,170, Е =0,166,Е =0,168, что соответствует по калибровочной кривой 3,1 мг метицилли-,на. 0,1 мл исходного раствора содержит 3,1 мг метициллина. Содержаниеметициллина в растворе 31 мг/мл.Как видно из примера, определениеможно проводить, используя навескуили свежеприготовленный водный раствор метициллина.П р и м е р 3. Построение калибровочной кривой для определения метициллина.Готовят шкалу растворов в 96 ,-ном этаноле с различным содержанием мети 1 циллина в каждой пробе (см. табл. 1),1244148 Таблица 1 Объем Проба КоличествометициллиО спиртового Е раствора (пробы), мл на впробе,мг 15 1 5,0 2 5,0 3 5,0 4 5,0 5 5,0 6 5,0 0,055 0,040О,э 095 Оэ 100 2 б 0,145 0,160 0,265 0,250 0,358 0,430 0,380250,426 Т а б л и ц а 2 Оптическая плотность растворов, Е,при внесении 1 н. соляной кислоты, мл Концентрациясоединения 1,7 10,05 0,1 0,5 1,0 1,5 2,0 0,190 0,400 0,190 0,400 0,400 0,390 0,430 0,410 0,01 0,360 0,300 0,390 0,320 0,02 Определение проводят по описанной методике, В качестве контроля сравнения используют 962-ный этанол, обрабатывая его, как описано в методике. 5Результаты определения приведены в табл, 1 На чертеже приведен график покаl зывающий наличие прямой пропорцио-30 нальной зависимости между содержанием метициллина в пробе и оптической плотностью окрашенного раствора.П р и м е р 4. Определение метис циллина в смеси пенициллинов. 35Готовят смесь карбенициллина, ампициллина, бензилпенициллина, оксациллина и метициллина (по 10 мг каждого антибиотика) и растворяют эту смесь в 5 мл 96 Ж-ного этанола. Про воднт определение содержания метициллина по методике, описанной в примере 2.Оптическая плотность окрашенного раствора: Е=0,475, Е =0,490, Е, = 45 =0495, что составляет по калибровочной кривой 9,75 мг метициллина. Ошибка определения 0,25 мг, К=+5 Х. 4Как видно из примера, испытанныепинипиллины - карбенициллин, ампициллин, бензилпенициллин и оксациллинне мешают определению метициллина.При проведении реакции с воднымирастворами метициллина используюттолько свежеприготовленные растворыввиду нестойкости метициллина. Нужнотакже соблюдать ряд условий для проведения реакции, подбор который описан в примерах 5-7 (порядок внесениякомпонентов, оптимальные соотношениякомпонентов, растворитель - реакционная среда).П р и м е р 5. Влияние порядкавнесения компонентов,Готовят раствор 20 мг метициллинав 10 мл 967.-ного этанола и делят егопо 5 мл в две прибирки, Первую пробуобрабатывают,как описано в методике по примеру 2, а во вторую пробирку приливают сначала 0,5 мл 1 н. соляной кислоты, а потом 3 мл 0,05 Е-,ного хлороформного раствора соединения 3 . Во второй пробирке реакцияне развивается. Таким образом, дляразвития реакции вносить компонентынеобходимо в предлагаемом порядке.П р и м е р 6. Подбор оптимальных соотношений и концентраций компонентов реакции (соединения 1 и соляной кислоты),Готовят .спиртовой раствор метициллина с содержанием 2 мг/мл. РазЛивают раствор по 5 мл в 54 пробирки. Готовят хлоройормный растворсоединения 1 в пределах концентрации 0,01-0,2 Е. По описанной в примере 2 методике проводят определениеметициллина, изменяя в каждом ряду( см. табл. 2) концентрацию соединения 1 и количество вносимой 1 н. соляной кислоты. Нормальность солянойкислоты выбрана в связи с изученностью гидролиза метициллина.В табл. 2 приведены результатыфотометрического определения в единицах оптической плотности (Е)1244148 Продолжение табл.2 Оптическая плотность растворов, Е,при внесении 1 н. соляной кислоты, мл Концентрациясоединения 1,Х 10 15 20 0,5 0,205 0,460 0,500 0,470 0,360 0,330 0,220 0,480 0,525 0,500 0,395 0,380 0,03 0,04 0,05 0,220 0,490 0,530 0,490 0,400 0400 006 0,220 0,480 0,505 0,480 0,370 0,360 0,270 0,07 0,400 0,420 0,4 О 0,400 0,380 0,10 0,275 0,380 0,400 0,405 0,395 0,390 0,390 О,390 0,20 0,290 0,390 0,390 0,390Из табл. 2 видно, что максималь ная величина экстинкций наблюдается в пределах концентрации соединения) от 0,03 до 0,067. (оптимум при 0,053) и в пределах количества внесенной 1 н. соляной кислоты от 0,1 до 1,0 мл (оптимум 0,5 мп).Оптимальное соотношение компонентов (0,05 Ж-ного хлороформного раствора соединения 1, спиртового раствора метициллина и 1. н, соляной кислоты) по объему, соответственно 3:5: :0,51П р и м е р 7. Влияние растворителя (реакционной среды) на развитие реакции соединения 1 с метициллином.Установлено, что реакция соединения 1 с метициллином происходит в 4 О среде низших спиртов - метилового и этилового,хуже - в среде пропилового спирта. В спиртах с углеродной цепью больше, чем С, реакция не развивается. Прочие растворители, кроме диэтилового эфира в слабой степени, также не дают развития реакции. В среде этанола образуется продукт малиновой окраски, в среде метанола - зеленой.50П р и м е р 8. Определение чувствительности реакции соединения 1 с метициллином в чистом виде и в сыворотке крови.Аналогично построению калибровоч ной кривой готовили ряд проб с содержанием метициллина менее 1 мг в пробе (см. табл. 3). По описанной метоцике проводили определение метициллина.В опыте использовали сыворотку, полученную из донорской, абортной и плацентарной крови, а также смесь этих сывороток. Готовили ряд пробирок, наливая в них по 0,9 мл любой из названных сывороток крови. Отдельно разводили в физиологическом растворе матициллин и делали серию разведений, как при построении калибровочной кривой (содержание метициллина от 10 до 0,625 мг/мп). Из разведений брали 0,1 мл и вносили количество метнциллина в сыворотку крови. Содержание метициллина в пробе сыворотки соответствовапо его содержанию в 0,1 мл физиологического раствора из разведений.Каждую пробу сыворотки обрабатывали для экстракции 5 мп смеси спирта с диэтиловым эфиром (1:1) или с хлороформом (1:1), Выбор растворителей обусловлен тем, что для экстракциипенициллинов из водных растворов используют именно эти растворители, как наиболее доступные, причем коэффициент распределения пенициллина в орга" нической и водной фазе составляет для эфира 14;1, для хлороформа 37:1,Через 2-3 ч экстракт фильтровали для удаления осадка и проводили с надосадочной жидкостью цветную реакцию по методике, описанной в примере .2. Результаты определения оптической плотности на СФприведены в табл. 3.1244148 Т а б л и и а 3 Калибровочная шкала СодержаниеметицилЭкстракт изсыворотки Е Е Е Ез Е лина впробе, мг 0,056 0,050 0,040 0,050 0,045 0,043 0,025 0,030 0,030 0,025 0,025 0,020 .0,012 0,015 0,015 0,015 0,011 0,011 0,006 0,005 0,005 0,005 0,007 0,005Не обнаруживается Не обнаруживается 1,0 0,5 0,250,125 0,063. Составитель В. Тихонов Редактор К. Волощук Техред О.Сопко Корректор С. ШекмарЗаказ 3770/26 Тираж 379 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР. по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-полиграФическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Как видно из табл. 3, чувствитель п ность определения метициллина в сыворотке крови соответствует чувствительности самой, методики и составляет 0,125 мг в 5 мл 967.-ного этанола или экстракта (для последнего это 25 соответствует содержанию в 1 мл сыворотки крови).П р и м е р 9, Определение содержания метициллина .в сыворотке крови в модельном опыте на животных (ж 30 ухало).Кролику вводили внутримышечно 1 г метициллина и не позже, чем через 25-30 мин, брали кровьПолучали сыворотку крови и 1 мл ее обрабатывали, как описано в примере 8 (элюировали, фильтровали и проводили цветную реакцию с раствором соединения 1 ). Определяли оптическую плотность (Е) окрашенной неводной фазы: Е, =0,058, Е =0,063, Е, =0,061, что составляет по калибровочной кривой 1,25 мг метициллина, Содержание метициллина в сыворотке крови 1,25 мг/мл.Таким образом, возможно определение метициллина в сыворотке крови теплокровного животного.