Способ определения дозы вакцины

Изобретение относится к медицине, вчастности к патологической физиологии, иможет быть использовано для комплекснойоценки реактогенности и иммунобиологической активности вакцин.Целью изобретения является ускорениеи повышение точности определения дозывакцины.Способ осуществляют следующим образом.Определение человеко-дозы проводят вдва этапа, На первом этапе определяют иммуногенную дозу вакцины для животных спомощью общепринятых иммунологическихметодик (реакции агглютинации, преципитации, вибриолиза, фагоцитоза и т.д.) илипутем сравнительных расчетов по дозам ранее испытанных вакцин этого типа. На втором этапе в зависимости от цели эксперимента производят либо оценку иммуногенности разных серий вакцины или вакцинных штаммов, или выбор иммуногенной иареактогенной дозы вакцины для человекапо изменению энергетического заряда адениловой системы лимфоцитов крови животных,вызываемому исследуемой вакциной,Для оценки иммуногенности разных серий вакцин или разных вакцинных штаммов берут три группы морских свинок (по10 особей в каждой). Первой группе вводят подкожно рекомендованную дозу вакцины А, второй - В, третьей - физиологической раствор и через 24 ч определяютэнергетический заряд адениловой системылимфоцитов. Вакцина, вызывающая достоверно более выраженное увеличение энергетического заряда адениловой системы лимфоцитов, оценивается как более иммуногенная и менее реактогенная.С целью выбора иммуногенной и ареактогенной дозы вакцины для человека (новоговакцинного препарата, новой производственной серии, нового вакцинного штамма) исследуют энергетический заряд адениловой системы лимфоцитов крови морских свинок,Для этого берут 11 групп животных по10 особей в каждой группе. Первую группуживотных иммунизируют подкожно дозойвакцины, выбранной на первом этапе по иммунологическим тестам или рассчитаннойтеоретически, с второй по десятую группыживотных - дозами в 2, 4, 8, 16, 32 разаменьшими и в 2, 4, 8, 16, 32 раза большимидозами, чем та, которой иммунизировалипервую группу животных. Одной группе вводят в качестве плацебо физиологическийраствор (контрольная группа).Через 24 ч у животных определяют энергетический заряд адениловой системы лимфоцитов, Выделение лимфоцитов проводятобщепринятым методом,Энергетический заряд вычисляют по формуле Эткинсона на основании определения 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 концентраций АТФ, АДФ, АМФ ферментным методом.Принцип метода определения концентрации АТФ основан на сочетании ферментативных реакций дефосфорилирования содержащегося в крови АТФ и дегидрирования эквивалентного количества НАД.Н, по убыли которого (регистрируемой при помощи спектрофотометра при длине волны 340 нм) рассчитывают концентрацию АТФ. Определение концентрации АДФ и АМФ основано на реакции фосфорилирования (фосфоенолпируватом и пируваткиназой) содержащегося в без белковом экстракте лимфоцитов АДФ и дегидрирования (лактатдегидрогеназной) эквивалентного количества НАД.Н АМФ фосфорилируют в экстракте с помощью аденилаткиназы и определяют образовавшийся при этом АДФ (два эквивалента), Содержание АДФ и АМФ рассчитывают по убыли экстинкции при длине волны 340 нм.Исследование проводят по следующей схеме.Взятие крови. Кровь забирают из сердца в градуированную пробирку со шлифом и стеклянной пробкой (емкостью 20 мл). В пробирку предварительно наливают 5 мл среды 199 (для культуры тканей) с 2 - 3 каплями гепарина. Пробирку закрывают пробкой и осторожно перемешивают. В зависимости от того, сколько крови получено от животного (обычно 6 - 8 мл), в пробирку добавляют среду 199 так, чтобы отношение среда; кровь было 1: 1.Приготовление градиента плотности.76/о-ный верографин смешивают с дистиллированной водой в пропорции 1:4,5, так как к ампуле верографина (20 мл) добавляют 90 мл воды и с помощью денсиметра выводят плотность раствора (добавлением верографина или воды) до 1,077 г/мл,Центрифугирование. В химически чистые центр ифужные пробирки емкостью 1 О мл с внутренним диаметром 12 - 13 мм до половины наливают водный раствор верографина с плотностью 1,077 г/мл. Затем в пастеровскую пипетку набирают разведенную кровь и осторожно по стенке, удерживая пробирку в наклонном положении (45), наслаивают кровь на раствор верографина. Соотношение объемов составляет 1:1, Пробирки центрифугируют 15 мин при 420 д. В результате лимфоциты занимают положение в середине пробирки над слоем верографина в виде беловатого кольца. Над лимфоцитами находится диффузный мутный слой тромбоцитов, а еще выше - прозрачная плазма. На дне пробирки собираются эритроциты и гранулоциты. В слое расположенного над ними верографина находятся в виде легкого помутнения агрегаты гранулоцитов с тромбоцитами и лимфоцитами. Пользуясьпастеровской пипеткой, соединенной трубочкой со шприцом, отсасывают слой лимфоцитов. При отсасывании нужно соблюдать максимальную осторожность, чтобы невызвать перемешивания. Полученная взвесьнеизбежно содержит примесь верографинаи тромбоцитов. Чтобы отмыть примесь, полученную суспензию лимфоцитов смешивают в отношении 1:2 со средой 199 и центрифугируют 10 мин при 15000 об./мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок10суспензируют в среде 199, доводя объем до4 мл. Все перечисленные процедуры необходимо проводить при температуре не выше +4 С. Далее в лимфоцитах определяютконцентрации АТФ, АДФ, АМФ,15Определение АТФ. 1 мл лимфоцитарнойсуспензии помещают в центрифужную пробирку и добавляют 4 мл охлажденной 0,6 нхлорной кислоты. Хорошо смешивают и оставляют при комнатной температуре 10 мин.Затем центрифугируют при 3000 об/мин втечение 10 мин. Надосадочную жидкостьотделяют. В чистую стеклянную кювету спектрофотометра с длиной световой дорожки 1 смпомещают 2 мл реактива, содержащего триэтаноламиновый эфир (0,5 М), сульфат магния (4 ммоль), 3-фосфоглицерат (6 ммоль).Последовательно добавляют 0,2 мл 2,5 ммольраствора НАД.Н и 0,2 мл полученной надосадочной жидкости. Содержимое кюветытщательно перемешивают и через 5 мин наспектрофотометре при длине волны 340 нм 30определяют оптическую плотность Е. Измерение проводят против воздуха. Если оптическая плотность выше 0,500 и в используемом спектрофотометре нет фотоумножителя,измерение можно проводить против раствора пикриновой кислоты (1 - 2 капли351,2 О/о-ной пикриновой кислоты на 100 млводы). Далее в эту же кювету добавляют0,02 мл суспензии, содержащей смесь ферментных препаратов - глицеринальдегидфосфат дегидрогеназы и фосфоглицераткиназы. Ферменты должны находиться в концентрациях не ниже 560 и 80 ИЕ/мл соответственно. Содержимое кюветы перемешивают и через 10 - 15 мин (пока не прекратится реакция) определяют оптическую плот 45ность Еа. Концентрацию АТФ рассчитываютпо следующей формулеАТФ (мкмоль/мл лимфоцитарной суспензии) = (Е 1 - Е ) Х 4,71.Определение концентрации АДФ. 3 мллимфоцйтарной суспензии помещают в цен 50трифудную пробирку и прибавляют 3 млохлажденной 1 н, хлорной кислоты, хорошосмешивают и оставляют при комнатнойтемпературе 10 мин. Затем центрифугируютпри 3000 об/мин. 4,0 мл надосадочной дидкости переливают в новую пробирку и добавляют туда 0,8 мл реактива, содержащегоКСОь (0,5 М) и триэтаноламиновый буфер(0,5 М). Смешивают и оставляют в ванне со льдом О мин. После этого при комнатной температуре фильтруют. В чистую стеклянную кювету с длиной световой дорожки 1 см последовательно помещают 2,0 мл фильтрата, 0,2 мл реактива, содержащего фосфенолпируват (О ммоль), КСг (1,3 М), МАМБО (0,4 М), а также 0,2 нм НАД.Н (2,5 ммоль) и 0,02 мл суспензии лактатдегидрогеназы в концентрации 320 ИЕ/мл. Содержимое кюветы тщательно перемешивают и через 5 мин измеряют оптическую плотность Е при длине волны 340 нм против воздуха (или раствора пикриновой кислоты). Далее добавляют 0,02 мл суспензии пируваткиназы в концентрации 320 МЕ/мл. Содержимое кюветы перемешивают и через 5 - 10 мин (пока не остановится реакция) определяют оптическую плотность Ед, Концентрацию АДФ рассчитывают по следующей формуле.АДФ (мкмоль АДФ/мл суспензии лимфоцитов) = (Е 1 - Е) Х 0,4354.Определение концентрации ЛМФ. После определения оптической плотности Е в ту же кювету добавляют 0,002 мл суспензии аденилаткиназы 500 ИЕ/мл. Смешивают и через 15 - 20 мин (пока не прекратится реакция) определяют оптическую плотность Е . Концентрацию АМФ рассчитывают по следующей формуле.ЛМФ (мкмоль АМФ/мл суспензии лимфоцитов) = (Е - Ез) Х 0,2189.Определение энергетического заряда. После определения концентраций адениловых нуклеотидов в суспензии лимфоцитов рассчитывают энергетический заряд адениловой системы по формуле2 АТФ) + АДФ 1(АТФ) + (ЛДФ) + (АМФ) где (АТФ), (АДФ), (АМФ) - концентрация АТФ, АДФ, АМФ, мкмоль/мл суспензии лимфоцитов.Иммуногенную и ареактогенную дозу для человека рассчитывают по формуле Рч = = 1/16 (Тд - Ид), где Рч - человеко-доза, выраженная в количестве клеток живой вакцины или в единицах активности химической вакцины (мг белка, ЕС или др.); Тд - токсическая доза вакцины; Ид - иммуногенная доза вакцины.Пример 1. Сравнительная оценка двух разных субкультур вакцинного штамма ЕВ: линии НИИЭГ сушки 1979 г. и линии япон-. ская сушки 1952 г.В опыт были взяты три группы животных:1-я - контрольная, в качестве плацеоо вводился физиологический раствор (10 животных); 2-я иммунизированные 100 тыс. микр, кл. вакцинного штамма ЕВ линии НИИЭГ (10 животных); 3-я - иммунизи 1175438рованные 100 тыс. микр. кл, вакцинного штамма ЕВ линия японская (10 животных),Через 24 ч в лимфоцитах крови был определен энергетический заряд системы аденилатов. В контрольной группе - 0,724 й + 0,018, а в группе животных, иммунизированных японской линией, - 0,805+ 0,010, линией НИИЭГ (Р (0,05), Следовательно, ее следует считать более иммуногенной. Такой вывод был проведен общепринятыми методами. Морским свинкам вводили однократно подкожно в объеме 0,5 мл по 40, 200, 1000, 5000 микробных клеток двухсуточной агаровой культуры, белым мышам по 200, 1000, 5000, 25000 микробных клеток в объеме 0,2 мл. На каждую дозу взято по 10 животных. Заражение вакцинированных животных (200 РСЕ) вирулентной культуры 1. рез 11 з проводили на 21-е сут. после вакцинации, В качестве контроля заражались чумой по 5 вакцинированных морских свинок по 200 и 1 0 С 1 (1 ЭС 1.= - 50 микр, кл.). Все контрольные животные погибли.Результаты определения иммуногенности культур приведены в таблице. Из этой таблицы видно, что японская линия вакцинного штамма чумного микроба неиммуногенна, так как ни одно из вакционированных животных не выжило, т.е. по иммуногенности эта субкультура штамма ЕВ не соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам,Вакцинный штамм чумного микроба линии НИИЭГ, принятый в качестве маточной культуры в производстве чумной вакцины, высоко иммуногенен.Пример 2. С целью выбора безвредной и иммуногенной дозы вакцины 6 группам морских свинок (по 10 особей в каждой) ввели подкожно 1 тыс., 100 тыс, 300 млн.,1200 млн., 4860 млн., 9600 млн. клеток живой чумной вакцины 1, Рез 11 з ЕЧ, Контролем служили 10 животных, которым былвведен физиологический раствор. Через 24 чпосле иммунизации в лимфоцитах крови поописанной методике определяли энергетический заряд адениловой системы.Иммуногенная доза (Ид) для морскихсвинок составляет 4800 млн, клеток вакцины, токсическая доза (Тд) - 9600 млн. кл.Одна человеко-доза составляет Дч == К (Тд - Ид) = (9600 млн. - 4800 млн) ХХ 1/16 = 300 млн. Эта серия вакцины былапроверена на людях, У людей в указанной15 дозе отмечалась выраженная иммунологическая перестройка и отсутствовали недопустимые поствакцинальные реакции, т. е. выбранная доза была иммуногенной и ареактогенной,Пример 3. Выбор безвредной и иммуногенной человеко-дозы холерогена-анатоксина серии 2.С целью выбора безвредной и иммуногенной дозы препарата 6 группам свинокморских (по 10 особей в каждой) введено25 подкожно 4800, 9600, 19200, 38400, 76800,153600 ЕС токсина, Контрольной группе морских свинок в качестве плацебо вводилсяфизиологический раствор. Через 24 ч в лимфоцитах определяли энергетический зарядадениловой системы.Для животных максимальная иммунизирующая доза (Ид) холерогена-анатоксинасоставляет 9600 ЕС, токсическая доза