Способ получения -лимфоцитов

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИРЕСПУБЛИК з(51) С 01 й 33/4 8 ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ ОСУДА О ДЕЛ САНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВ РСКОМУ СВИ ЕЛЬСТ ИФОЦИ- колонщ и й ия чис хрома- дейст 2-67 кГдли(21) 3310164/28- 3(71) Ростовский ордена Дружбы народовмедицинский институт(56) 1. Авторское свидетельство СССРИ 787994, кл. 6 01 й 33/48, 1980.2, Авторское свидетельство СССРй 787995, кл. О 01 й 33/48, 1980.3. Векслер Х . М Сочне в А. М .,Попов 0;В. Сравнительное излучениеметодов получения фракций лимфоцитовпериферической крови, обогащеннойТ- и В-лимфоклетками. В кн. "Новыеиммунорегулирующие препараты и иммунологические методы". Рига, "Зинатне"1978, с. 39-44 (прототип)(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТТОВ с помощью хроматографии ке с нитроном, о т л и ц а с я тем, что, с целью повыш тоты целевого продукта, пере тографией на смесь лимфоцито вуют ультразвуком с частотой интенсивностью 0,12-0,14 Вт/ тельностью 50- 70 с.1 105Изобретение относится к медицине,преимущественно иммунологии, и можетбыть использовано в лабораторной практике для получения чистой популяцииТ-лимфоцитое и исследования их функциональных свойств в целях диагностики ряда иммунопатологических состоянии аИзвестен способ дифференцированияТ- и В-лимфоцитов человека путем обработки их стимулятором розектооЬразования с эритроцитами барана илиэритроцитами мыши и оценкой результатов реакции 1 и 21 .Однако эти способы требуют дорогих 5и дефицитных реактивов для своеговоспроизводства,Известен способ получения Т-лимфоцитов путем выделения из смеси Ти В"лимфоцитов с помощью хроматогра- дФии на колонне с нитроном 3.Недостатком способа является низкая чистота целевого продукта загрязнение его В-лимфоцитами,Цель изобретения - повышение чистоты целевого продукта,Поставленная цель достигается тем,что в способе получения Т-лимфоцитовпутем выделения их из смеси Т- иВ-лимфоцитов с помощью хроматографии зона колонке с нитроном, перед хроматографией на смесь лимфоцитов действуют ультразвуком с частотой 62-67 кГцинтенсивностью 0,12-0,14 Вт/см 2 длительностью 50-70 с .Способ осуществляют следующим об 35разом.В силиконированную пробирку к гепаринизированной донорской крови добавляют раствор декстрана молекулярным40слоем 250 тыс,), После 20 мин экспозиции надосадочную жидкость отсасывают,добавляют среду 199 и центрифугируютпри 1 000 об/мин. Супернатант сливают,а к осадку приливают 0,2 мл дистилли 45рованной воды. Затем добавляют 2,0 млсреды 199 и отмывают дважды при000 об/мин в течение 7 мин, Надосадочную жидкость отбрасывают, осадокосторожно встряхивают и к нему пипеткой приливают О,ч мл среды 199. Этупробирку со взвесью димфоцитов помещают в сосуд с водой объемом до0,5 л, в который опускают волноводультразвукового генератора, Воздействие .ультразвуком проводят при частоте 62-67 кГц, интенсивности, 0,120,1 Вт/см , в течение 50-70 с. Послеобработки ультразвуком колонку, зач 27полненную волокном нитроном для агойцели используют шприц на 5 ил, который на 2-3 мл заполнен нироном, предварительно активированным 0,2 Н соляной кислотой и промытым теплой средой 199 непосредственно перед использованием) заливают 1,0 мл взвеси лимфоцитов, обработанной ультразвуком,инкубируют 15 мин при 37 С . Пропусоканием через шприц 10,0-15,0 мл теплой среды 199 медленной струей получают в промывной суспензии чистуюпопуляцию Т-лимфоцитов,П р и и е р 1. В силиконированную пробирку с О,ч мл гепаринизированной крови приливают 0,1 мл 14-ногораствора декстрана для получениявзвеси лейкоцитов. Надосадочную жидкость отсасывают, центрифугируют при1 000 об/мин а течение 7 мин, добавляют к осадку 0,2 мл дистиллированной воды и пипетируют 15 с. Затемвновь отмывают средой 199 центрифугированием при 1000 об/мин в течениемин, и взвешивают. осадок в О,ч млсреды 199 для получения концен 1 рацииклеток в пределах 20-2,5 Х 10 кл/мл,6Полученную клеточную взвесь в пробирке опускают в сосуд с водой вместес волноводом ультразвукового генератора и подвергают действию ультразвука частотой 65 кГц, интенсивностью0,12 Вт/см", длительностью 60 с.Сразу поспе воздействия ультразвуком пропускают взвесь лейксцитов через колонку, заполненную нитроном,предварительно активированным 0,2 Мсоляной кислотой и промытым теплойсредой 199 перед использованием. Заполненную колонку помещают в терностат на 30 мин при 37 фС. После инкубации через колонку пропускают15,0 мл теплой среды 199 медленнойструей, таким оЬразом вымывая неприлипшую фракцию Т-лимфоцитов,Промывную суспензию центрифугируют при 1 000 об/мин в течение 7 мин,осадок взвешивают в.среде 199, доводя концентрацию полученной взвеси до2,0-2,5 х 10 кл/мл. В две маленькиесиликонированные пробирки разливаютпо 0,2 мл полученной взвеси и приливают по 0,2 мл нативных эритроцитовбарана (для Т-лимфоцитов) и эритроцитов мыши в другую пробирку (дляВ-лимфоцитов). Проводят реакциюТ-розеткообразования, после чего обобразовавшиеся розетки фиксируютраствором 3-ного глутаральдегида,1051421 Составитель Е . ЖитниковаРедактор Е, Лушникова Техред.М.Тепер КорректорО. Тигор еТираж 873 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Заказ 8656/43 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 отмывают дистиллированной водой цент.рифугированием при 1 000 об/мин, полученный осадок переносят на предметное стекло, Мазок фиксируют, окрашивают по Браше с подсчетом образовавшихся розеток на 100"200 лимфоцитов.Также с полученной суспензиейТ-лимфоцитов проводят реакцию В"розеткообраэования, фиксируют образо-.вавшиеся розетки раствором глута Оральдегида, отмывают дистиллированнойводой, полученный осадок переносятна предметное стекло, мазок фиксируют,окрашивают по Браше и производят под-счет образовавшихся розеток на 100- 15200 лимфоцитов,До воздействия ультразвука количество В-клеток во фракции Т-лимфоцитов Гыло 90 при абсолютном количестве клеток, равном 1030, после воздействия ультразвука примесь В-кле ток во фракции Т"лифоцитов отсутствовала. Предлагаемый способ техни чески прост, позволяет получить очищенную популяцию Т-лимфоцитов и может найти применение в экспериментальной медицине, в лабораторной практике при исследовании функциональных свойств Т-лифоцитов в целях диагностики ряда иммунологических состояний,