Способ получения суммарного гистонаиз животного сырья

Союз Советских ОПИСАНИЕ )84 ЗИ 5ИЗОБРЕТЕ Н И ЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Социалистических Республик) М К,зА 01 Ы 6 22) Заявлено 17.12.79 (21) 2854720/60-15с присоединением заявки-23) Приоритет -43) Опубликовано 07.07.81. Боллетень2545) Дата опубликования описания 07.07.81 сударствениый комитет СССРделам изобретеиии и открытий 647.962088.8) асио ет и ордена Трудовогогосударственный униве ниЖданова Я СУММАРНОНОГО СЫРЪЯ 4) СПОСОБ ПОЛУЧ ГИСТОНА ИЗ ЖИВ Изобретение относится к области молекулярной биологии, в частности к способам получения комплекса хромосомальных основных белков-гистонов (суммарный гистон). Гистоны используются в модельных 5 экспериментах при исследовании механизма взаимодействия этих белков с дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК) в дезоксирибонуклеопротеидном комплексе (ДНП) или в хроматине ядер тканей жи вотных и растений, т, е. с целью изучения структуры хроматина, что является одной из основных проблем современной молекулярной биологии при изучении физико-химических основ жизни. 15Гистоны - ядерные белки основного характера, которые асоциированы с дезоксирибонуклеиновой кислотой и негистоновыми белками в составе хроматина ядер клеток животных и растений. В настоящее вре мя описано несколько способов выделения гистонов.Известен прямой способ выделения хроматина из лизата клеток тимуса телят, который является первой ступенью в способе 25 получения гистонов П 1. Известно 21 усовершенствование указанного способа, но авторы не приводят данных по извлечению гистонов из хроматина.Описан прием экстракции гистонов 20,25 н. НС 1 из хроматина с последующим диализом экстракта против воды и течение 2 - 3 сут и его лиофилизацпей 131.Известен способ, взятый в качестве прототипа и заключающийся в следующем 141.10 г замороженной печени, разрезают и гомогенизируют с 200 мл 0,075 М ХаС 1 + 0,024 М 1 Ча ЭДТА (этилендиаминотетрауксусная кислота) + 2-октиловый спирт в течение 1 мин при 16000 об/мин и 4 мин при 8000 об/мин, Гомогенат (около 250 мл) фильтруют через 2 слоя марли и через 2 слоя капроновой ткани. Затем смесь центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 мин, При центрифугировании осаждается хроматин. Осадок хроматина промывают 100 мл 0,075 М 1 чаС + 0,024 М Ка 2 ЭДТА + 2-октиловый спирт и центрифугируют. Осадок хроматина три раза промывают 0,05 М трис-буфером; рН 8, следующими объемами - 80, 40 и 40 мл, Каждый раз осадок гомогенизируют и центрифугируют при 10000 об/мин в течение 15 мин. Выход хроматина составляет 50% (по дезоксирибонуклеиновой кислоте). Осадок хроматина суспендируют в 30 мл 0,05 М трис-буфере, рН 8. По 5 мл суспензии наслаивают на 25 мл 1,7 М раствор сахарозы (раствор сахарозы приготовлен на 0,01 М трис-буфере, рН 8) и центрифугируют при 7000 об/мин843915 60 65 33 ч. Выход хроматина составляет 70 О/о (по дезоксирибонуклеиновой кислоте) . Осадок хроматина суспендируют в 0,01 М трис-буфере, рН 3, и диализируют против того же буфера в течение 18 ч. После диализа осадок хроматица растворяют в 10 обьемах 0,015 М ХаС 1 + 0,001 М натрий линоцнокислый. Нерастворившиеся частицы удаляют центрифугированием при 10000 об/миц в течение 30 мин. К полученному раствору добавляют 1/4 обьема 1 и. Н.504, перемешивают в течение 30 мин и центрифугируют 20 мин при 1200 об/мин, Экстракт сохраняют. Осадок после центрифугирования повторно обрабатывают уже 0,4 н. Н 2804 (1/4 объема) и экстракты объединяют, К объединенным экстрактам добавляют 4 объема охлажденного абсолютного этанола. Смесь выдерживают 24 ч при - 10 С. Выпадает осадок суммарного гистона. Осадок собирают центрифугированием при 2000 об/мин в течение 20 миц, суспендируют в абсолютном этаноле и цецтрифугируют при 10000 об/мцн. Промывание осадка этанолом повторяют еще два раза, после чего его высушивают. Препарат суммарного гистона, полученный этим способом, характеризуется следующими показателями: со. держание белка 90%, примеси негнстоновых белков 10%, содержание фракции аргипинбогатых до 30 - 50%, бактерицидная активность гистонов це исследовалось.Указанный способ имеет следующие недостатки:Конечный продукт имеет недостаточную чистоту - до 10/о негистоцовых примесей; в нем отсутствуют определенные фракции гистонов (аргинипбогатые) из-за их агрегации с примесными негистоновыми белками, неполноты осаждения из раствора при использовании этацола.Осаждение суммарного гистоца нз кислотного экстракта этанолом не обеспечивает выделение фракций аргининбогатых гцстонов, в состав которых входит значительное количество неполярных аминокислот, в силу чего они находятся в растворимом состоянии в этаноле.Бактерицидная активность в суммарном препарате сниженная за счет отсутствия фракций аргининбогатых гистонов.Целью изобретения является повышение чистоты, выхода и сохранение бактерицидной активности конечного продукта.Поставленная цель достигается тем, что в известном способе получения суммарного гистона из животного сырья, включающем гомогецизацию в буферном растворе при рН 8, осаждение и промывку хроматина, экстракцию и осаждение гистона, в раствор гомогенизации вводят лимоннокислый натрий и бисульфит натрия, экстракцию суммарного гистона проводят непосредственно из осадка хроматина, а осакдение осуществляют ацетоном в течение 0,5 - 1,0 часа при температуре +4 С, причем объемное соотношение экстракта и ацетона равно1: 7 - 10.Изобретение обеспечивает содержаниебелка не менее 98/о, содержание примесинегистоновых белков 1 - 2%, содержаниефракций аргининбогатых гистоцов 80 -95 о.Бактерицидная активность сохраняется1 мг суммарного гистона на 1 мл бактериальной суспензии.Обеспечение чистоты препарата суммарного гистона, т. е. исключение содержания в нем негистоновых белков, достигает,6 ся экстракцией суммарного гистона непосредственно из осадка хроматина,Хроматин ядер клеток животных представляет дезоксирибоцуклеопротеидцыйкомплекс (ДНП) с рибонуклеиновой кисло 20 той, с двумя классами белков; белки основного характера - гистоны, на долю последних приходится 70 - 80% от общего количества белков хроматина и кислые белки -ядерные ферменты.Известно, что при растворении хроматица в растворах низкой ионной силы наруцастся пространственная структура ДНП ипри этом гистоны могут формировать комплексы с негистоновыми белками, При последующем извлечении гистонов из раствора хроматина негистоцовые белки могутсоэкстрагироваться с гистонами и тем самым загрязнять конечный продукт.Прием экстракции суммарного гистонанепосредственно из осадка хроматина обеспечивает полную и избирательную экстракцию гистонов и позволяет избежать загрязпения препарата негистоновыми белками,так как последние остаются связанными с40Для обеспечения максимального выходасуммарного гистона, содержащего все пятьфракций гистона, в предлагаемом способев раствор при гомогенизации ткани вводят46 натрий бисульфит и натрий лимоннокислыйдля ингибирования протеиназ, что исключаст протеолиз фракций гистонов Н 1 и Н 4.Выход полноценного конечного продукта, содержащего все пять фракций гистонов50 (Н 1, Н 2 А, Н 2 В, НЗ, Н 4) в эквимолярномсоотношении (20% по весу) достигается использованием высоких объемов ацетона(при объемном соотношении экстракта иацетона 1: 7 - 10), а такке проведением66 процесса осаждения при +4 С в течение0,5 - 1 ч, так как в данных условиях всефракции гистонов находится в нативной аформе в нерастворимом состоянии. Получение суммарного препарата, содержащего пять фракций гистона, обеспечивает его высокую бактерицидную активность в отношении Е. со 11. Положительный эффект наблюдается при добавлении 1 мг суммарного гистона на 1 мл бактериальной суспензии.843915 10 15 20 2 г 30 35 49 45 50 55 60 65 5Таким образом, предлагаемый способ заключается в следующем.Свежезамороженный тимус телят измельчают на мясорубке и по порциям гомогенизируют с буферным раствором рН 8, содержащим 0,14 М натрия хлористого, 0,05 М натрия бисульфата и 0,01 М натрия лимоннокислого.Гомогенат фильтруют через два слоя марли, через четыре слоя марли, потом через восемь слоев марли. Фильтрат центрифугируют. Осадок собирают и промывают буферным раствором рН 8. Осадок гомогенизируют с 0,4 н. серной кислотой и вьсдеркивают при +4 С 10 - 12 ч.Экстракт отделяют центрифугированнсм и фильтруют.К экстракту прибавляют охла:кденный, подкисленный ацетон в объемных соотношении экстракта и ацетона 1: 7 - 10 и выдерживают 0,5 - 1 ч при +4 С.Осадок суммарного гистона собирают на фильтре, промьсвают ацетоном и высушивают,Содеркание белка не менее 98"/о,Чистота по электрофрезу на ПАГЭ; содержит все пять фракций; примеси негистоновых белков до 1 - 2%.Бактерицидная активность - 1 мг суммарного гистона на 1 м,ч бактериальной суспензии.П р и м е р 1, 2 кг свежезамороженного тимуса телят измельчают на мясорубке и измельченную массу по порциям гоыогенизируют с 10 л раствора, содержащего 0,14 М натрия хлористого, 0,05 М натрия бисульфпта и 0,01 М натрия лимонпокислого, рН 8.Гомогенат фильтруют через два, через четыре и потом через восемь слоев марли.Фильтрат центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 мин при 0 - 4 С.Осадок собирают и заливают 4 л раствора, содержащего 0,14 М натрия хлористого, 0,05 М натрия бисульфита и 0,01 М натрия лимоннокислого, рН 8,Смесь центрифугируют при 1500 об(мип в течение 15 мин, температура 0 - 4 С.Осадок собирают и измеряют его обьем. Осадок суспендируют в 4 л 0,4 н. раствор серной кислоты и по порциям гомогенизируют.Гомогенизированную смесь оставляют экстрагироваться при 0 - 4 С в течении 10 - 12 ч,После экстрагирования смесь центрифугируют при 2500 об/мин в течение 15 мин, температура 0 - 4 С,Надосадочную жидкость собирают и фильтруют через слой ваты и марли. К фильтрату при перемешивании приливают 7 объемов охлажденного подкисленного ацетона (1 мл конц. Нй 04 на 2 л ацетона). Суспензию выдерживают при +4 С 1 ч.Осадок гистона суммарного оседает на 6дно сосуда. Надосадочный слой сливают.Осадок двухкратно промывают неподкисленным ацетоном, собиракт, фильтруясуспензию через стеклоткань. Отф.сльтрованный осадок высушивают на воздухе доисчезновения запаха ацетона, потом сушатв вакуумэксикаторе над едким кали,Выход: 20 г гистона суммарного; содержание белка 100 О/о; чистота по электрофорезу в полиакриламидном геле: содержит всепять фракций примеси негистоновых белков - следы.Бактерицидная активность - 1 мл суммарного гистона на 1 мл бактериальной суспензии,П р и м е р 2. 1,8 кг свежезамороженного тимуса телят измельчаюч на мясорубке иизмельченную массу по порциям гомогенизируют с 9 л раствора, содержащего 0,14 Мнатрия хлористого, 0,05 М натрия бисульфита, 0,01 М натрия лимоннокислого, р 1-1 8.Гомогенат фильтруют через два, черезчетыре и через восемь слоев марли.Фильтрат центрифугируют при 1500обЬсьссс в тсчсппс 15 мпн, температура0 - 4 С.Осадок собирают и заливают 3,5 л раствора, содержащего 0,14 М натрия хлористого, 0,05 М натрия бисульфпта, 0,01 Мнатрия лимоннокислого рН 8,Смесь центрифугируют при 1500 об/минв течение 15 мин, температура О - 4 С.Осадок собирают и измеряют его объем.Осадок суспендируют в 3,5 л 0,4 и. раствора серпой кислоты и по порциям гомогенизируют.Гомогенизированную смесь оставляютэкстрагироваться при 0 - 4 С, в течение10 - 12 ч. После экстрагирования смесьцентрифугируют при 2500 об/мин в течение15 мин, температура 0 - 4 С.Надосадочную жидкость собирают ифильтруют через слой ваты и марли. Кфильтрату при перемешивании приливают10 объемов охлажденного, подкисленногоацетона (1 мл конц. НЬО, на 2 л ацетона).Суспензию выдерживают при 1-4 С 0,5 ч.Осадок гистона суммарного оседает надно сосуда. Надосадочный слой сливают.Осадок двухкратно промывают неподкисленным ацетоном, собирают, фильтруя суспензию через стеклоткань.Отфильтрованный осадок высушиваютпа воздухе до исчезновения запаха ацетона, потом сушат в вакуум-эксикаторе надедким качи Вывод: 20 г гистона суммарного; содержание белка 99,51 о; чистота по электрофорезу в полиакриламидном геле: содержит все пять фракций, примеси негнстоновых белков - следы.Бактерицидная активьсость - 1 мг суммарного гистона па 1 мл бактериальной суспензии.843915 Составитель М. Дранишников Текред И. Заболотнова Корректор Н. Федорова Редактор Е, Хорина Заказ 4600 Подписное Изд. 433 Тираж 712 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Загорская типография Упрполиграфиздата Мособлисполкома 7П р и м е р 3. 2 кг свежезамороженного тимуса телят измельчают на мясорубке и измельченную массу по порциям гомогенизируют с 10 л раствора, содержащего 0,14 М натрия хлористого, 0,05 М натрия бисульфита и 0,01 М натрия лимоннокислого, рН 8.Гомогенат фильтруют через два, через четыре и потом через восемь слоев марли,Фильтрат центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 мин, температура 0 - 4 С,Осадок собирают и заливают 4 л раствора, содержащего 0,14 М натрия хлористого, 0,05 М натрия бисульфита, 0,01 М натрия лимоннокислого, рН 8.Смесь центрифугируют при 1500 об/мин, в течение 15 мин, температура 0 - 4 С.Осадок собирают и измеряют его объем. Осадок суспендируют в 4 л 0,4 н. серной кислоты и по порциям гомогенизируют.Гомогенизированную смесь оставляют экстрагироваться при 0 - 4 С в течение 10 - 12 ч, После экстрагирования смесь центрифугируют при 2500 об/мин в течение 15 мин, температура 0 - 4 С. Надосадочную жидкость собирают и фильтруют через слой ваты и марли.К фильтрату при перемешивании приливают 9 объемов охлажденного подкисленного ацетона (1 мг конц. НяЯО.г на 2 л ацетона).Суспензию выдерживают при температуре 4 С в течение 45 мин.Осадок гистона суммарного оседает на дно сосуда. Надосадочный слой сливают, Осадок двухкратно промывают неподкисленным ацетоном, собирают, фильтруя суспензию через стеклоткань,Отфильтрованный осадок высушиваюг на воздухе до исчезновения запаха ацетона, потом сушат в вакуум-сушильном эксикаторе над едким кали,Выход 20 г гистона суммарного; содержание белка 98/о; чистота по электрофорезу на ПАГЭ: содержит все пять фракций; примеси негистоновых белков 0,5/О.Бактерицидная активность - 1 мг суммарного гистона на 1 мл бактериальной суопензии,Технико-экономический эффект изобретения заключается в выделении суммарно 8го гистона высокого качества: не содержащего негистоновых примесей, обладающего хорошей растворимостью, содержащего все пять фракций и обладающего бактерицидной активностью.Таким образом, получение высококачественного препарата суммарного гистона обеспечит его применение в научных исследованиях в области молекулярной биологии 10 (изучение структуры хроматинов в модельных опытах), в препаративной биохимии (получение отдельных фракций), как субстрата при ферментативных реакциях (опыты по ацетилированию и фосфорилированию гистонов), при исследованиях антибактериальных и антивирусных свойств и в практической медицине (при лечении ряда кожных заболеваний). Способ легко осуществим в промышленных условиях и по сравнению с известным способом дает экономию 3000 руб, на 1 кг продукта и обеспечивает экономию сырья, материалов и рабочего времени. 25 Формула изобретения Способ получения суммарного гистонаиз животного сырья, включающий гомогенизацию в буферном растворе при рН 8,30 осаждение и промывку хроматина, экстракцию и осаждение гистона, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения чистоты,выхода и сохранения бактерицидной активности конечного продукта, в раствор гомо 35 генизации вводят лимоннокислый натрий ибисульфит натрия, экстракцию суммарногогистона проводят непосредственно из осадка хроматина, а осаждение осуществляютацетоном в течение 0,5 - 1,0 ч при 4 С, при40 чем объемное соотношение экстракта и ацетона равно 1: 7 - 10,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. 6. Мо 1 ес, В 1 о 1 оду, ч, 1, р. 1 - 20, 1959,2, Мейой 1 п Се 1. В 1 о 1 ору, ч. 17, сЬ. 3.р, 27 - 50, 1978.3. Мейодз 1 п Епгуп 1 о 1 оду, ч, 12. раг 1. В.,50 зес 1, 5, р. 65 - 84, 1968.4. Мейодз 1 п Епуугпо 1 оду, ч, 12, раг 1. Ввеса. 1, р. 3 - 65, 1968 (прототип).