Способ получения аденовирусных антигенов

(19 61 К 39/00,(5 И 70 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ПОЛУЧЕНИЯ АДЕНОВИРУСНЫХ(57) Изобремедицинскойгии, в частчения антиг бласти ение относитс усолополуи ветеринарнои в ости к технологи нови ных препарато ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИ Н А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной молекулярнобиологии и генетики ВАСХНИЛ(56) Воц 1 ап 8 ег Р.А., Рцч 1 оп Р. 1.агеезса 1 е ргерагагдоп оГ зо 1 цЫе айепоч 1 гцз Ьехоп репоп апй Е 1 зЪег ап 1 яепз дп ЬЦЬТУ рцгдг 1 ед Гога. - Ецг.1. В 1 осЬеа., 1973, 39, р. 37-42. русов, Целью изобретения является повьпдение выхода целевого продукта иупрощение способа получения аденовирусных антигенов, Для этого аденовирусы выращивают в культуре клеток человека и животных, отделяют зараженные клетки от культуральной среды,извлекают антиген дистракцией сначалабуферным раствором хлорида йатрия,а затем дополнительной экстракцией5 М раствором хлорида натрия, послечего экстракт обрабатывают органическим растворителем и дополнительнообъединяют с культуральной жидкостью,а очистку и концентрирование осуществляют двухступенчатой сорбционной сЩхроматографией сначала на фенилсефарозе, а затем аа ДЕАЕ-оефарозе. В ре- (/)зультате указанных манипуляций достигается высокая частота аденовирусного антигена ( 957), а его выход увеличивается в 1,5-2 раза. 1 .табл, 1 136Изобретение относится к областимедицинской и ветеринарной вирусоло-.гии, в частности к технологии получения антигенных препаратов аденовирусов,Цель изобретения - повышение выхода целевогопродукта и упрощениеспособа,П р и м е р 1, Монослой перевиваемой культуры клеток человека линииНервыращивают во вращающихся бутылях объемом 2 л в устройстве дляроллерного культивирования клеток.Для выращивания клеток используютсреду 199 с 103 сыворотки крупногорогатого скота. На сформированный мо-.нослой клеток Нер(20 бутылей по60 млн, клеток) наносят инфекционныйаденовирус человека типа 1 (АЙЬ 1) вдозе 0,05 бляшкообразующих,единиц наклетку в полном объеме поддерживающей среды (100 мл среды 199 с 2 Ж аминопептида .на бутыль), Через 72 ч,когда весь монослой поврежден цитопатическими изменениями, среду культивирования сливают, а в бутыли добавляют по 10 мл 10 М натрий-фосфатного буфера, РН 7,2 и снимают клеткисо стекла с одновременным их лизисомпутем встряхивания,Суспензию лизированных клеток (общий объем 120 мл) гомогенизируют вмеханическом ножевом размельчителев течение 2 мин, после чего добавляют. 200 мл 5 М раствора НаС 1 и дополнительно гомогенизируют 2 мин, К гомогенату добавляют 200 мл четыреххлористого углерода и встряхивают на лабораторном шейкере в течение 5.мин,после чего смесь разделяют центрифугированием в течение 15 мин, при1500 об/мин, Верхнюю водную фазу(объем 395 мл) собирают и объединяютсо средой культивирования (объем950 мл). Объединенную фракцию подкисляют до рН 6,4 добавлением 1 МЮаНРОд и наносят на колонку (диаметр 5 см, высота слоя сорбента 6 см),содержащую фенилсефарозу С 1.-4 В ("фармация", Швеция) и уравновешенную 10 Мнатрий-фосфатным буфером (РН 6,4),со скоростью 1400 мл/ч. Колонку промывают с той же скоростью 1 л 10 Мнатрий-фосфатного буфера (рН 7,2),после чего элюируют антиген 307-нымэтанолом на 10 М натрий-фосфатном буфере (РН 7,2).со скоростью 200 мл/ч,В элюаре регистрируют наличие белков4342 2 Выход очищенного антигена Ай Ь 1соответствует 16 мг на 10- клеток(таблица, пункт 5), тогда как по известному способу максимальный выходсоставляет 9 мг на 10 клеток,Кроме основной фракции очищенного 40 антигена (таблица, пункт 5 ) на носХледнем этапе получают его дополнительные фракции, содержащие частичноочищенный антиген (таблица, пункты 5"6и 5 ), который может быть получен вочищенном состоянии путем повторнойхроматографии на анионообменнике(пример 2), Аналогичным способом могут быть очищены антигены аденовирусов обезьян и крупного рогатого скоП р и м е р 2. Монослой первичнойкультуры клеток почки зеленой мартышки (ПЗМ) выращивают в плоских культуральных флаконах объемом 1,5 л всРеде, указанной в примере 1. Насформированный слой клеток ПЗМ (60сосудов по 25 млн, клеток) наносятинфекционный аденовирус низших обезьян ЯА 7 (Ай ада 16 (клон МБ) в 5 10 15 20 25 30 по поглощению при 280 нм, Белковыйпик объединяют в одну фракцию (объем185 мл) и подвергают дальнейшей очистке,Для этого элюат с фенилсефарозынаносят со скоростью 200 мл/ч на колонку ДЕАЕ-сефарозы (2,6 х 6 см),уравновешенную 10 М натрий-фосфатнымбуфером (РН 7,2). Далее колонку промывают с такой же скоростью 200 мл10 М натрий-фосфатного буфера (РН7,2), содержащего 0,2 М ИаС 1. Элюциюантигена с ДЕАЕ-сефарозы проводятлинейным повышением концентрацииМаС 1 от 0,2 до 0,4 М на 10 М натрийфосфатном буфере (РН 7,2), Общий объем градиента 160 мл, скорость элюции30 мл/ч. фракции объемом 3 мл собирают с помощью автоматического кол"лектора фракций, В полученных фракциях определяют содержание антигена спомощью ракетного иммуноэлектрофорезав агарозе с антисывороткой противгексона аденовируса обезьян Ай здш 16,содержание суммарного белка определяют методом Лаури и степень чистотыантигена - с помощью дискэлектрофогреза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия.Результаты получения антигена проиллюстрированы в таблицез 13дозе 0,02 бляшкообразующих единиц наклетку в полном объеме поддерживающейсреды (150 мл среды, согласно примеру 1, на флакон). Через 96 ч культуральную среду сливают, клетки снимаюти экстрагируют из них антиген, какуказано в примере 1. Хроматографическую очистку антигена из объединеннойфракции среды культивирования и экстракта клеток ведут, как указано впримере 1, за исключением того, чтообъединенную фракцию подкисляют дорН 6,0, а размеры хроматографическихколонок увеличивают (высота слоя сорбента соответственно 10 и 15 см дляфенилсефарозы и ДЕАЕ-сефарозы), Колонку ДЕАЕ-сефарозы промывают 500 мл10 М натрий-фосфатного буфера (рН7,2), содержащего 0,07 М МаС 1, а элюцию ведут градиентом концентрацииИаС 1 от 0,07 до 0,2 М на 10 М натрийфосфатом буфере (общий объем градиента 350 мл), Собирают фракции объемом 7 мл, Пик очищенного антигена(фракции 25-36) объединяют. Фракциичастично очищенного антигена (21-24и 37-42) объединяют, (общий объем68 мл), разбавляют до 200 мл 10 Мнатрий-фосфатным буфером и наносятна колонку 2,6 х 8 см ДЕАЕ-сефарозы,уравновешенной 10 М натрий-фосфатнымбуфером, содержащим 0,07 М ИаС 1. Колонку промывают 150 мл того же буфера, после чего элюируют антиген линейным градиентом концентрации НаС 10,07-0,2 М на 10 М натрий-фосфатномбуфере (рН 7,2), Общий объем градиента 200 мл, собирают фракции по5 мл. Очищенный антиген выходит вофракциях 21-26. Эти фракции объединяют с очищенным антигеном с 1-й колонки ДЕАЕ-сефарозы, Общий объем препарата, очищенного гексонового антигена 110 мл, содержание гексонаАс 1 зш 16 в . 84 мг,Для удаления солей и концентрирования очищенного антигена проводятхроматографию на фенилсефарозе, Дляэтого объединенную фракцию наносят .на колонку фенилсефарозы (1,6 хх 12 см), уравновешенной 10 М натрийфосфатным буфером (рН 6,4), со скоростью 10 мл/ч, Колонку промывают стой же скоростью 50 мл 5 М БН 4 СООСНд,после чего элюируют сконцентрированный антиген 307-ным этанолом на дистиллированной воде со скоростью20 мл/ч. Белковый пик (по поглощению64342 антигены аденовирусов сохраняют полную антигенность и иммуногенность и могут применяться в качестве. диагностических и вакцинных препаратов,45 Формула изобретения Способ получения аденовирусных антигенов, включающий выращивание аденовирусов в культуре клеток, отделение зараженных клеток от культу- ральной жидкости, разрушение клеток путем лизиса и извлечение аденовирусного антигена экстракцией буферным раствором хлорида натрия, обработку экстракта органическим растворителем с последующей очисткой и концентри 50 55 при 280 нм) собирают в одну фракцию(объем 25 мл) и подвергают лиофильной сушке. Выход антигена 80 мг, чтозсоответствует 53 мг на 10 клеток,содержание гексона Ай зш 16 - 977.П р и м е р 3. Монослой культурыклеток МДВК выращивают во вращающихсябутылях объемом 500 мл в устройстведля роллерного культивирования клетокв среде, укаэанной в примере 1, Заражают клетки (20 бутылей по 20 млн.клеток) препаратом инфекционного аденовируса крупного рогатого скота15 Ай Ъоа 3) (0,01 БОЕ/клетку) в поддерживающей среде (50 мл на флакон). Через 120 ч среду сливают, а антигениз клеток экстрагируют, как указанов .примере 1, Хроматографическую очистку антигена проводят, как опйсанов примере 1, за исключением тоЬо, чтоэлюцию антигена с фенилсефарозы проводят 203-ным изопропанолом на 10 Мнатрий-фосфатном буфере (рН 7,2), На25 этапе ДЕАЕ-сефарозы используют концентрации ИаС 1, указанные в примере2. Очищенный антиген Ад Ьоз 3 (объем38 мл) концентрируют. Для этого кпрепарату добавляют 100 мл охлажденЗО ного до 0 С ацетона, смешивают и оставляют смесь на 1 ч при -20 С. После этого осадок антигена отделяютцентрифугированием (20 мин при3000 об/мин при 0 С) и растворяют в3 мл О, 15 М ИаС 1, Выход антигенаАй Ьоз 3 - 81 мг (что соответствует.20 мг/10 клеток), чистота 963.ДПредлагаемый способ полученияантигена обеспечивает повышение вы 40 хода препарата в 2-5 раэ по сравнению с известным способом,Полученные предлагаемым способомЭтапвыделения гена,Х от пре- парате, 7. исходного 1 Среда культивирования 950 3230 23 0,71 48 2 Экстракт кле- ток 395 350 25 6,9 52 3 Объединенный исходный препа 1,3 100 1345 3580 48 рат 4 Элюат с фенилсефарозы(46) (61,8) (36,9) (74) (76) г) сумма (а + б + в) Составитель С,Светлышев КорректорЛ.Пилипенко Техред Л. Олийнык Редактор Е,Папп Заказ 6505/5 Тираж 655 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений-и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, гУжгород, ул. Проектная, 4 5 1364342 . 6рованием сорбционной хроматографией, ционную хроматографию проводят с исо т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с пользованием фенилсефарозы с рН 6,0- целью повышения выхода целевого про,4, при этом элюцию осуществляют дукта и упрощения способа, при извле- ,. ЗОБ-ным раствором этанола или 207.-ным чении аденовирусного антигена осуще- раствором изопропанола с последующей ствляют дополнительную экстракцию сорбцией элюэнта на ДЕАЕ-сефарозе и 5 М раствором хлорида натрия, после . элюцией антигена 10 М натрий-фосфатобработки экстракта органическим рас- ного буфера рН 7,2 с линейным повышетворителем его дополнительно объеди нием концентрации в нем хлористого няют с культуральной жидкостью, сорб- натрия от 0,2 до 0,4 М.