Способ получения фосфатидилглицерина

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскикСоциапистическикреснубпик и 831129(23)Приоритет А 61 К 31/66 С 07 Г 9/1 О Ввудвретввнный квинтет ееер в девев кзееретевнй н фтерытвй .2) Авторы изобретения Э. Я Власенк тецкий и Т 1) Заявит невосточный государственный 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИИ ФОСФА ЛИЦЕРИНА имико 6;4 выделяют фо в соОтнош ную кисл ар тся к еннос и.я фосфа фосфол ии глиц олоночн и олученидействия й фри исутстсткой к пособеначителфатидн выход фосен и составЯ я кислота Однако при этом фатидилглицерина н ляет 257, чистая ф не выделяется. обретения - повышение выхоо продукта и одновременное фосфатидной кислоты. енная цель достигается тем, н растворяют в диэтиловом ученную фракцию обрабатывам Б и элюирование проводят роформ-метанол в соотношеприсутствии аммиака для фосфатидилглицерина и при и смесью хлороформ-метанол е а целев олучени Поставл что лецити эфире, пол ют трнлоно смесью хло нии 94:6 в получения элюировани К Изобретение относ мацевтической промьппИзвестен способ п дйлглицерина путем зы Д на лецитин в пр на с последующей очи хроматографией 1 1. П р и м е р 1. Препарат фосфолипазы Д готовят гомогенизацией капусты с 0,05 М натрий-ацетатньм буфером . рН 5,6. Соотношение ткань-буфер 1;3. Полученный экстракт центрифугируют при 5000 об/мин 15 мин. Надосадочную жидкость используют в качестве препарата фосфолипазы Д, Ферментативную смесь готовят путем растворения 1,5 г чистого лецитина в 300 мл диэтилового эФира (5 мг/мл), смешивают с 300 мл 0,05 М натрий-ацетатного буфера рН 5,6, с 300 мл препарата фосфолипазы Д, 600 мл 0,02 М раствора хлористого кальция,и 600 мл глицерина. Реакциюопроводят при 26 С 0,5 ч при постоянном перемешивании. В ходе реакции расщепляется около 953 лецитина. Соотношение фосфатидилглицерина и фосфатидной кислоты около 3:1. Полученная фра ция содержит фосфатидную кислоту, около 22 Ж, лецитин около 5 Ж, фосфатидил35 Из 1 г фракции.фосфатидилглицерина и фосфатидной кислоты получают сразу 376 мг (около 60 Х) хроматогра"55 фически чистого фосфатидилглицерина и 300 мг с примесью фосфатидилметанола и лецитина, полученных в начале и конце второй систеМы. Их доочистка.3 8312 глицерин около 63 Х, фосфатидилметанол около ЗХ, и нефосфолипидные примеси около 7 Х.Фракцию фосфатидилглицерина и фосфатидной кислоты извлекают 4 раза сис 5 темой хлороформ-метанол 2:1, одной третьей частью от реакционной смеси каждый раз. Хлороформ-метанольныйслой упаривают до 50 мл, прибавляют 50 мл 2%-ного раствора трилона Б в 10 системе вода-метанол 9:1, тщательно перемешивают, центрифугируют и верхний слой отбрасывают, Нижний слой отмывают 30 мл дистиллированной воды ,от избытка трилона Б. Водный слой от брасывают, нижний упаривают досуха и растворяют в 10 мл хлороформ-метанола 94:6 с добавкой 25 Х водного аммиака (3 мл/л системы). Фракция готова к нанесению иа колонку. Для разделения 20 1 г смеси веществ используют 50 г силикагеля Л 40/)00 О Силикагель суспензируют в хлороформ-метаноле 94:6 с добавкой 25 Х водного аммиака. (3 мп/л системы) и загружают в колонку диамет ром 4,5 смс высотой адсорбционного столба 10 см. Отношение диаметра к высоте адсорбционного столба 1:2.Для элюирования используют)1. 4 л хлороформ-метанола 94:6 30 с добавкой 25 Х водного аммиака (3 мл/ /л системы). Вымывают нефосфолипидные примеси и фосфатидилметанол. В послед" нем литре системы .заметно появление фосфатидилглицерина;2, 10 л хлороформ-метанола 928с добавкой 25 Х водного аммиака (4 мл//л системы). Вымывают хроматографически чистый фосфатидилглицерин. В первом литре системы заметно небольшое 40количество фосфатидилметанола, в последних полутора литрах появляютсяследы лецитина.3. 3 л хлороформ-метанола 7:3 сдобавкой 25 Х водного аммиака (6 мл/л 45системы). Вымывают лецитин. В последних полутора литрах выходит лецитин с примесью фосфатидной кислоты.4. 1,5 л хлороформ-метанола 6:4,Вымывают хроматографически чистую 50фосфатидную кислоту. 9 4на аналогичной колонке дает еще150 мг хроматографически чистого фосфатидилглицерина, Конечный выход хроматографически чистого фосфатидилглицерина составляет около 84 Х от исходного фосфатидилглицерина после Ферментолиза. Выход хроматографическичистой фосфатидной кислоты составляет 130 мг (около 60 Х).П р и м е р 2. Препарат Фосполипазы Д готовят гомогенизацией семянарахиса с дистиллированной водой. Соотношение ткань-вода 1:3. Полученныйэкстракт центрифугируют при 5000 об//мин:15 мин. Надосадочную жидкостьиспользуют в качестве препарата фосфолипазы Д.Ферментативную .смесь готовят растворением 1,5 г лецитина "Олайне"(смесь лецитина, сфингомиэлина, лизолецитина, Фосфатидилэтаноламина инейтральных липидов) в 300 мл диэтилового эфира 5 мг/мл, смешивают с300 мл препарата Фосфолипазы Д,;300 мл дистиллированной воды, 600 мл0,02 М раствора хлористого кальцияи 600 мл глицерина. Реакцию проводятпри 37 в течение 1 ч при постоянномоперемешивании, В ходе реакции расшепляется около 90 возможных предшественников Фосфатидилглицерина ифосфатидной кислоты.Полученная фракция содержит фосФатидную кислоту 14,2 Х, сфингомиэлин2,6 Х, лецитин )0,7 Х, фосфатидилгли церин 50,)Х, фосфатидилэтаноламинЗ,ОХ, фосфатидилметанол 3,1 Х, лизолецитин 0,6 Х, фосфатидилинозит 2;6 Х,нефосфолипидные примеси 13,)ГОбработку полученной фракции трило-,ном Б и подготовку колонки проводятпо примеру 1. Для элюнрования используют:1. 5 л хлороформ-метанола 94;6 с добавкой 25 Х водного аммиака (3 мл/л системы). Вымывают нефосфолипидные примеси и Фосфатидил-метанол. В последнем литре системы заметно появление фосфатидилглицерина.2. 9 л хлороформ-метанола 92:8 с добавкой 25 Х водного аммиака (4 мл/л системы). Вымывают хроматеграфически чистый фосфатидилглицерии. В первом литре системы заметно небольшое количество фосфатидилметанола, в последнем литре появляются следы фосфатидил.этаноламина.Формула изобретенияСпособ получения Фосфатидилглицерина путем действия Фосфолипазы Д на лецитин в присутствии глицерина с последующей очисткой колоночной хроматографией, о т л и ч а ю щ и й с я тем; что, с целью повышения выхода целевого продукта и одновременного по,лучения Фосфатидной кислоты, лецитин 5 83113. 4 л хлороформ-метанола 7:3 с до-бавкой 253 водного аммиака (6 мл/л системы). Вымывают фосфатидилэтаноламин, лецитин, сфингомиэлин, фосфатидилинозит со следами фосфатидной кислоты в конце системы.4. 1,5 л хлороформ-метанола 6:4. Вымывают хроматографически чистую фосфатидную кислоту.Из 1 г фракции фосфатидилглицерина 10 и фосфатидной кислоты получают сразу320 мг (около 643 ) хроматографически чистого фосфатидилглицерина и 280 мгс примесью фосфатидилметанола и Фосфатидилэтанопамина, полученных в на чале и конце второй системы. Доочистка последней на сходной колонке даетеще 140 мг хроматографически чистого фосфатидилглицерина, Конечный выходхроматографически чистого фосфатидил глицеринасоставляет около 923 от исходного фосфатидилглицерина после Ферментолиза. Выход хроматографически чистой Фосфатидиновой кислоты составляет 92 мг (около 653). 25П р и м е р 3. Препарат фосфолипазы Д готовят по примеру 2.Ферментативную смесь готовят растворением 1,5 г лецитина "Олайне"(смесь лецитина, сфингомиэлина, лиза- ЗО лецитина, фосфатидилэтаноламина и нейтральных липидов ) в 300 мл диэтил- вого эфчра 5 мг/мл, смешивают 300 мл препарата фосфолипазы Д, 300 мл дистиллированной воды, 600 мл 0,02 М 35 раствора хлористого кальция и 600 млО . глицерина. Реакцию проводят при 37 в течение 1 ч при постоянном перемешивании. В ходе реакции расщепляется около 953 возможных предшественников40 фосфатидилглицерина и Фосфатидной кислоты. Полученная Фракция содержит фосфатидную кислоту 12,2 Ж, фосфатидилглицерин 43,4 ., лецитин 4,43, сфингомиэлин 2,63, Фосфатидилметанол 2,23,45 фосфатидилэтаноламин 3,43, фосфатидилинозит 2,7 Ж, лизолецитин 0,43 нефосфолипидные примеси 27,8 Х.Обработку полученной фракции трилоном Б и подготовку колонки проводят50 по примеру 1, В отличие от последнего изменено соотношение диаметра 2,2 см к высоте адсорбцианного столба 22 см до 1:10.Для элюирования используют:551. 2,7 л хлороформ-метанола 94:6 с добавкой 253 водного раствора аммиака (3 мл/л системы). Вымывают не 29 6 фосфолипидные примеси и фасфатидилметанол. В последнем литре системы заметна следовое количество фосфати" дилглицерина.2. 6 л хлороформ-метанола 92;8 с добавкой 252 водного аммиака (4 мл/л системы)Вымывают хроматографически чистый Фосфатидилглицерин. В последнем литре системы идет смесь фосфатццилглицерина и Фосфатидилэтаноламина в незначительном количествее3. 3 л хлороформ-метанола 7:3 с добавкой . 25 водного раствора аммиака (6 мл/л системы). Вымывают фосфатидилэтаноламин, Фосфатидилинозит, лецитин, сфингомиэлин. В конце системы появляется следовое количество фосФатидной. кислоты.4, 1,5 л хлороформ-метанола 6;4. Вымывают хроматографически чистую фосфатидную кислоту.Из 1 г фракции фосфатидилглицерина и Фосфатидной кислоты получают сразу 350 мг (окало 80 Ж) хроматографически чистого Фосфатидипглицерина и 100 мг с примесью Фосфатидилметанола и фосфатиднлэтаноламина, полученных в на чале и конце второй системы. Доочистка последнейна сходной колонке дает еще 50 мг хроматографически чистого фосфатидилглицерина. Конечный выход хроматографически чистого фосфатидилглицерина составляет около 923 от исходного фосфатидилглицерина после ферментолиза. Выход хроматографически чистой фосфатидной кислоты составляет 77 мг (около 63).Использование предлагаемого спасопо сравнению с известными способами,позволяет быстро, просто, с экономнойзатратой растворителей одновременнополучить хроматографически чистые фосфатидилглицерин и фосфатидную кислотус высоким выходом 84-92 Х фосфатидилглицерина и 60-65 Ж фосфатидной кислоты.7 831129 8растворяют в диэтиловом эфире, полу- нии 6:4 выделяют фосфатидную кислоту.ченную фракцию обрабатывают трилономБ и элюирование проводят смесью хло- Источники информации,роформ-метанол в соотношении 94:6 в принятые во внимание при экспертизеприсутствии аммиака для получения1. М. Не 11 ег. РбозрИо 11 разе 01 пфосфатидилглицерина и при элюировании реапцй зеес 1 з Во 11, Зо 1 С 61 щ В 1 о 1.смесью хлороформ-метанол в соотноше-. 1968, 50, 9, )395-409.Составитель .С. МалютинаРедактор О. Малец ТехредМ Рейвес Корректо С. ШекмарЗаказ 3005/15 Тираж 687 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4