Способ определения абсцизовой кислоты в тканях растений

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН ш 4 С 01 Б 33/48 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Институт физиологии растений АН УССР(56) Кефели В.И. и Кислин Е,Н, Газохроматографическое определение абсци. зовой и индолил-уксусной кислот в растительных тканях. Физиология растений, 1982, 29,2, 407-414.Ба 1 оп 1,0., РигЫсаоп оЕ р 1 ап ацх 1 п С ро 1 уашЫе гайдн - 1 ауег сйгошаго 8 гарЬУ, Л, СЬгошагоцгарпу, у. 70, 9 11, 1972, р, 202-205. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АБСЦИЗОВОЙ КИСЛОТЫ В ТКАНЯХ РАСТЕНИЙ (57) Изобретение позволяет одновременно определять абсцизовую и индолил-уксусную кислоты путем экстрагирования растительного материала в водном метаноле с упариванием экст.801233052 А 1 ракта. После растворения в метаноле сухого остатка его наносят на пластинку (П) со слоем силикагеля на подложке в промежуток между направляющими, размер которых 5-6 см в длину перпендикулярно нижнему краю пластинки с расстоянием между направляющими 8-10 мм. П помещают в содержащую 10- 5 Е-ный вдный аммиак хроматографическую камеру и хроматографируют до подъема раствора аммиака на высоту 4-5 см с последующим удалением отрезанием нижней части П параллельно ее нижнему краю на расстоянии 1-2 мм выше пигментированной зоны, На второй стадии верхнюю часть П хроматографируют в том же направлении с хлороформ- уксусной кислотой в качестве растворителя до подъема его на высоту 12- 13 см. После этого П высушивают, пооворачивают на 90 и хроматографируют в растворителе второй стадии, Количественную оценку осуществляют методом спектроденситометрии. 2 табл.Изобретение относится к аналитической химии, а именна к способам оп ределения абсцизовой и индолил-уксусной кислот в тканях растений методам хроматографии в тонком слое.Целью изобретения является повыш ние эффективности способа и одновременное определение абсцизовой и индолил-уксусной кислот.Способ осуществляется следующимобразом.1 г Фиксированного жидким азотом .свежего растительного материала экстрагируют трижды в течение 1 ч при5 С по 10 мл 80 в но водного метанола. Объединенный метанальныйэкстракт фильтруют и упаривают подвакуумом при 35-40 С. Сухой остаток растворяют в 100 мкл метанола иколичественно переносят 50 мкл этогораствора на пластинку с тонким слоемсиликагеля на алюминиевой или пластиковой подложке в промежуток междудвумя направляющими, Размер направляющих 5-6 см в длину перпендикулярно нижнему краю пластинки в левомуглу с расстоянием между направляющими 8-10 мм. Жидкость из микрошприца подается равномерно са скоростью,позволяющей раствору самопроизвольно распространяться по площади, огра.ниченнай направляющими. Пластинкупомещают в хроматографическую камеру, содержащую 12,5 .-ный водный аммиак, и хроматографируют до подъемафронта растворителя на высоту 4-5 см.После высушивания пластинки и удаления аммиачного запаха отрезают нижнюю часть пластинки параллельно еенижнему краю на расстоянии 1-2 ммвыше пигментированной зоны, Верхнюючасть пластинки помещают в хроматографическую камеру и разделяют в системе хлороформ - уксусная кислота(20:3). После подъема растворителя навысоту 12-13 см пластинку высушиваюто,поворачивают на 90 ; в левом углунаносят количественно стандартныерастворы абсцизовой и индолил-уксусной кислот в известной концентрации, проводят хроматографираваниев новом направлении в свежеприготовленной системе хлороформ - уксусная. кислота (20:3) . Количественное определение проводят методом спектроденситометрии при длине волны 280 нм,Количественный расчет производится методом абсолютной калибровки прииспользовании в качестве стандартныхвеществ абсцизоной и индолил-уксусной кисло т.Изменение условий нанесения образца, в частности размеров направляюцих и расстояния между ними, а такжеконцентрацИИ водного аммиака, аказыва.10 ет влияние на конечный результат,П р и м е р 1. 1 г фиксированногожидким азотом свежего растительногоматериала содержащего . 5 мкг абсцизавой кислоты и 5 мкг индолил-уксус.ной кислоты, экстрагируют трижды втечение 1 ч при 5 С па 10 мл 80 -ного водного метанола, Объединенныйметанольный экстракт Фигьтруют и упаоривают под вакуумом при 35-40 С. Сухой остаток растворяют в 100 мкл метанола и количественно переносят50 мкл этого раствора на пластинкутонким слоем силикагеля в промежутокмежду двумя направляющими размером 25б см в длину перпендикулярна нижнемукраю пластинки в левом углу с расстоянием между направляющими 1 О мм. Хроматографиравание проводят в 5 -ном,водном аммиаке на высоту подъема ЗОФронта растворителя 5 см. Дальнейшийход анализа аналогичен описанию осуществления способа. Процент определения составляет для абсцизовой кислоты 21,4 и для индолил-уксусной кис.- лоты 29,6. П р и м е р 2. 1 г фиксированногожидким азотом свежего растительногоматериала, содержащего 5 мкг абсци завой кислоты и 5 мкг индолил-уксусной кислоты, экстрагируют триждыв течение 1 .ч при 5 С по 1 О мл 80 - ного водного метанола. Объединенныйметанальный экстракт фильтруют и упаоривают под вакуумом при 35-40 С. Сухой остаток растворяют в 100 мкл метанола. и количественно переносят50 мкл этого раствора на пластинку стонким слоем силикагеля в промежутокмежду двумя направляющими размером6 см в длину герпендикулярно нижнемукраю пластинки в левом углу с расстоянием между направляющими 1 О мм.Хроматографиравание проводят в 12,5- Л нам водном аммиаке. Процент определениясоставляет для абсцизовой кислоты73,5 и для индолил-уксусной кислоты 85,7.П р и м е р 3.г фиксированного жидким азотом свежего растительного материала, содержащего 5 мкг абсцизовой кислоты и 5 мкг индолил-уксусной кислоты, экстрагируют трижды в течение 1 ч при 5 С по 1 О мл 80- ного водного метанола, Объединенный метанольный экстракт фильтруют и упаривают под вакуумом при 35-40"С. Сухой остаток растворяют в 100 мкл ме танола и количественно переносят 50 мкл этого раствора на пластинку с тонким слоем силикагеля в промежуток между двумя направляющими размером 6 см в длину перпендикулярно ниж 15 нему краю пластинки в левом углу с расстоянием между направляющими10 мм. Хроматографирование проводят 25 -ным водным аммиаком, Процент определения составляет для абсцизовой 20 кислоты 51,2 и для индолил-уксусной кислоты 59,4. П р и м е р 4. 1 г фиксированного жидким азотом свежего расти тельного материала, содержащего 5 мкг абсцизовой кислоты и 5 мкг индолил-уксусной кислоты, экстраги.о руют трижды в течение 1 ч при 5 С по 10 мл 80 -ного водного метанола . З 0 Объединенный метанольный экстракт фильтруют и упаривают под вакуумомопри 35-40 С. Сухой остаток растворяют в ОО мкл метанола и количественно переносят 50 мкл этого раствора на пластинку с тонким слоем силикагеля в промежуток между двумя направляющими размером 3 см в длину перпендикулярно нижнему краю пластинки в левом углу с расстоянием между направ ляющими 10 мм. Ход анализа аналогичен описанному в примере 2. Процент определения составляет для абсцизовой кислоты 10,2 и индолил-уксусной кислоты 13,7. 45П р и м е р 5. 1 г фиксированного жидким азотом свежего растительного материала, содержащего 5 мкг абсцизовой кислоты и 5 мкг индолил-ук" . сусной кислоты, экстрагируют трижды 50 в течение 1 ч при 5 С по 1 О мл 80 - ного водного метанола. Объединенный метанольный экстракт фильтруют ио упаривают под вакуумом при 35-40 С. Сухой остаток растворяют в 100 мкл 55 метанола и количественно переносят 50 мкл этого раствора на пластинку с тонким слоем силикагеля в промежуток между двумя направляющими размером 8 см н длину перпендикулярно нижнему краю пластинки в левом углу с расстоянием между направляющими 10 мм. Дальнейший ход анализа аналогичен описанному в примере 2. Процент определения Составляет для абсцизовой кислоты 59,6 и индолил-уксусной кислоты 68,3.П р и м е р б. 1 г фиксированного жидким азотом свежего растительного материала, содержащего 5 мкг абсцизовой кислоты и 5 мкг,индолил- -уксусной кислоты, экстрагируют трижды в течение 1 ч при 5 С по 10 мл 803-ного водного метанола, Объединенный метанольный экстракт фильтруют ио упаривают под вакуумом при 45-40 С. Сухой остаток растворяют в 100 мкл метанола и количественно переносят 50 мкл этого раствора на пластинку с тонким слоем силикагеля в промежуток между двумя направляющими размером 6 см в длину перпендикулярно нижнему краю пластинки в левом углу с расстоянием между направляющими 5 мм. Дальнейшийход анализа аналогичен описанному в примере 2. Процент определения составляет для абсцизовой кислоты 7,3 и для индолил-уксусной кислоты 13,2.П р и м е р 7. 1 г фиксированного жидким азотом свежего растительного материала, содержащего 5 мкг абсцизовой кислоты и 5 мкг индолил-уксусной кислоты, экстрагируют триждыов течение 1 ч при 5 С по 10 мл 80 . - го водного метанола, Объединенный метанольный экстракт фильтруют и упарио вают под вакуумом при 35-40 С. Сухой остаток растворяют в 100 мкл метанола и количественно переносят 50 мкл этого раствора на пластинку с тонким слоем силикагеля в промежуток междудвумя направляющими размером 6 см в длину перпендикулярно нижнему краю пластинки в левом углу с расстоянием между направляющими 15 мм. Дальнейший ход анализа аналогичен описанному в примере 2, Процент определения составляет для абсцизовой кислоты 35,9 и дляиндолил-уксусной кислоты 481.В табл.) приведено влияние изменения условий нанесения образца и концентрации водного аммиака на полноту определения абсцизовой и индолил- -уксусной кислот в растительном образце (на примере 5 мкг кислот.1233052 Таблица 11 Концентрация Вод Полнота опреРасстояние межДлина наПример деления кислот, %правляющих, см ного аммиака, % ду направляюшими,мм абсцизовой индолил- уксусной 21,4 29,6 73,5 85,7 51,2 59,4110,2 3,7 10 10 25 10 12,5 10 10 7,3 13,2 35,9 48,1 12,5 Результаты показывают, что опти- мальными условиями нанесения образцаявляются длина направляющих 6 см, расстояние между направляющими 10 мм,з 5 а оптимальной концентрацией для хроматографирования в первой системе является 12,5%-ный водный аммиак.В данных условиях очистки растительного экстракта количественно определяются абсцизовая и индолил-уксусная кислоты в различных растительных образцах.П р и м е р 8. 1 г фиксированной жидким азотом колеоптилей пшеницы, . 45 содержащий 5 мкг абсцизовой кислоты и 5 мкг индолил-уксусной кислоты, экстрагируют трижды в течение 1 ч при 5 С по 10 мл 80%-ного водного0метанола. Дальнейший ход анализа ана 5 О логичен описанному в примере 2. Полнота определения составляет для абсцизовой кислоты 72,5 и для индолил- -уксусной кислоты 83,3.П р и м е р 9. 1 г фиксированных 55 жидким азотом проростков кукурузы,12,559,6 68,3 содержащий 5 мкг абсцизовой кислоты и 5 мкг индолил-уксусной кислоты, экстрагируют трижды в течение 1 ч при 5 С по 10 мл 80%-ного водного метанола. Дальнейший ход анализа аналогичен описанному в примере 2. Полнота определения составляет для абсцизовой кислоты 8,5 и для индолил- -уксусной кислоты 88,0.П. р и м е р 10. 1 г фиксированных жидким азотом листьев подсолнечника, содержащий 5 мкг абсцизовойкислоты и 5 мкг индолил-уксусной кислоты экстрагируют трижды в течение 1 ч при 5 С по 10 мл 80%-ного водного метанола, Дальнейший ход анализа аналогичен описанному в примере 2 Полнота определения составляет для абсцизовой кислоты 53,1 и для индолил-уксусной кислоты 68,8. Из табл,2 следует, что полнота определения кислот предлагаемым способом в 1,5-2 раза вышее, чем известным,233052 Таблица 2 Полнота определения, Я Кислота Преплагаемый Известныйспособ Пророст- Листья куку- подсолКолеоптили пшенирузы нечника цы Абсцизовая 32,2 72,5 87,5 53,1 Индолил-уксусная 68,8 83,3 88,0 39,8 Составитель И.ТарееваТехред О,Сопка Корректор М.Самборская Редактор Р.Цицика Заказ 2763/46 : Тираж 778 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж; Раушская наб д. 4/5Производственно-полиграФическое предприятие, г.ужгород, ул.Проектная, 4 Из приведенных примеров видно, что предлагаемый способ повышает полноту определения абсцизовой и индолил-уксусной кислот в тканях рас- тений.30 Формула изобретения Способ определения абсцизовой кислоты в тканях растений путем экстракции из растительной ткани органическим растворителем, удаления твердой фазы, концентрирования жидкой фазы с последующей очисткой кислоты из концентрата двукратной хроматографией в тонком слое сорбента на пластине, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения эффективности способа и одновременного определения нндолил-уксусной кислоты, перед на несением концентрата на сорбент при: первой стадии хроматографирования на сорбенте наносят направляющие в виде двух параллельных борозд путем удаления сорбента, при этом длина бороз. ды 5-6 см, а расстояние между ними, 8-10 мм, на первой стадии используют систему растворителей в виде 10-157- ного водного раствора аммиака до т подъема его на высоту 4-5 .см с последующим удалением коэкстрактивных веществ с пластины, на второй стадии хроматографии полученное пятно кислот хроматографируют в том же направлении, при этом в качестве системы . растворителей используют хлороформ - уксусную кислоту до подъема растворителя на высоту 12-3 см, причем пятно, полученное после второй стадии, дополнительно хроматографируют в системе растворителя, используемого на второй стадии,приповороте пластинынао90, а количественное определение осуществляют методомспектроденситометрии.