Способ определения алкилрезорцинолов в зерне злаковых культур

ОП ИСАН ИЗОБРЕТЕН оюз Советс 5967 Соцмалистн чески Республик)Дополнительное к аат. саид-в М) Ваяв 02,77 21) 2457794 рисоедииением заявкиЗЗ/02 Ратаэаньй аиататСССРдалам изобратвекв аткрмте Гаау(23 итет -Опубликовано 05.04. 79.Бюллетен ь1 З 43,418.8) 8,04.7 ата опубликования описа Авторзобретеиия Сысо 7 Ц Заявитель сесоюзный ордена Ленина и ордена Трудового Красно селекционнс-генетический институтИЛРЕЗОРЦИНОЛОВКУЛЬТУР 15 Изобретение относится к селекция на улучщение химического состава злаковых культур, в частности селекции ржи и тритикале, на пониженное содержание,5-алкилрезорцинолов, - антиметаболитов, понижающих кормовые достоинства зерна этих культур.Известен флуорометрический способ определения алкилрезорцинолов, основанный на обработке 5-алкилрезорцинолов хлоро-, формом и 75 Ъ-ной щелочью. Метод оказался очень громоздким и вскоре был заменен автором на колориметрический способ, основанный на реакции азосочетания диазотированного п-нитроанилина (ДНА) с фенольными гидроксилами пезорцинового кольца алкилрезорцинолов 1.Дальнейщее усовершенствование этот способ получилв работе Стучинского и сотрудников 21Однако при этом способе необходимо тщательно измельчать зерно, а поскольку алкилрезорцинолы локализованы в наружных оболочках зерен, обладаюпих больщой эластичностью, достигнуть их тонкого измельчения очень трудно, Для этой цели служит специальный металлический стакан с металлическим шаром, в котором проводится экстрагирование алкилрезорцинолов при встряхивании на вибраторе, что усложняет их определение.С целью предотврашения сравнителт но быстрой. преципитации желтого диазс соединения(после добавления диазотированного п-нитроани лина), экстракт дополнительно разбавляют этанолом, В результате на один анализ расходуется 28 мл ацетона и 20 мл этанола.Кроме того, для определения алкилрезорцинолов берется навеска муки, равная 500 мг, Между тем, для проведения отборов на ранних этапах селекции желатель но проводить определение в одной половнике зерна, оставляя вторую для посева.11 елью изобретения является повыщение точности и упрощение анализа.Для достижения указанной цели алкипрезорцинолы экстрагируют этанолом яз655967 Таблица 1Влияние и-бутанола на повышение стабильностиокраски растворов азосоединения (экдтинкция в 4 мл раствора) Резорцинолы в 4 мл, мкг 265 0,285 67 0,74 78 1,20 0,22 0,40 0,45 2 0,9 слабая преципитаци+сильная преципитац ения 1.1 и по 0,5 мл раствораанного п-нитроанилина, переи оставляют при комнатнойе, Колориметрирование желтоа проводят через 1,5-2 ч при оотнощ азо мец температурго раство435 нм. оцелого зерна при 70-72 С в течение 15-18 ч при соотношении масса зерна- масса растворителя 1:20, затем к 0,5 мп этанольного экстракта добавляют 3 мл смеси этаноп-бутанол, взятых в эквива лентном соотношении.Повышение точности определения невозможно без предотвращения преципитации диазосоедипения.Реакция азосочетания диазотированногс п-нитроанилина с резорцинолами имеет свои особенности. В среде этанола при малых концентрациях резорцинолов реакция идет медленнее, чем при повышенных. В последнем случае уже через 15-20 мин после добавления ДНЛ цвет- ность раствора достигает максимума в то время, как при малых концентрациях для этого требуется 60 мин и более. Кроме того, при концентрациях апкипре 20 зорцинолов, превышающих 100 мкг %, в среде этанола развивается преципитаСпособ опредедения алкипрезорцинолов макромодификация) заключается в следующем.40,5 г зерна переносят в сухую пробир ку, добавляют 10 мл 95%-ного этанола (гидролизный высокой .чистоты), закрывают резиновой пробкой, обернутой. алюминиевой фольгой, отмечают уровень жидкос ти в пробирке восковым карандашом и погружают в водяную баню, нагреваниеопри 70 С ведут и течение ночи (15-18 ч), Утром охлаждают до комнатной темпера- туры и доводят уровень жидкости до мечки этанопом и тщательно встряхивают.Затем из каждой пробирки берут по 0,5 мп экстракта и переносят в сухую пробирку,добавляют по 3 мл смеси этанол-бутанол ция образующегося диаэосоединения, что приводит к падению цветности растворов,В целях предупреждения образования преципитатов реакцию диазосочетания рекомендуется вести в сильно разведе- ных спиртовых растворах или при замене части спирта ацетоном,Приведенная проверка антикоагуляционных особенностей ацетона показала, что он мало отличается по этим свойствам от этанола, Более подходяшим оказалось добавление н-бутанопа.Смесь этанол-бутанол в соотношении 1:1 предотвращает образование преципитатов азосоединения при концентрации алкипрезорцинолов, превышающей 300 мкг % (табл. 1), При расчете на сухой вес зерна это составляет 500 мг/кг, что превосходит максимальное содержание апкипрезорцинолов у наиболее богатой ими культуре - ржи. В ряде работ по ржи, а также по тритикале была установлена обратная корреляция между массой зерновок и содержанием в них алкилрезорцинолов. При рекомендуемой малой навеске зерна (0,5 г)это может сказываться на точности анализов. Для снижения величины погрешности следует из каждого образца брать по две параллельных навески, либо среднюю пробу составлять из разлоСледовательно, по содержанию алкипре 15зорцинолов шитковая и хохолковая частизерна различаются мало и определение ва хохолковой части может дать достоверные сведения по содержыппо их в целомя20зерне.Каждое зерно рассекают ножом надве половинки. Хохолковую часть взвешивают на торсионных весах и переносятв пробирку, а шитковую наклеивают на25лист бумаги при помощи бумажной плаотинки и нумеруют, В пробирку добавляют3,5 мл смеси этанол-бутанол (1:1) изакрывают резиновой пробкой,алюмщщевой фольгой, отмечжидкости восковым карандашомжают в водную баню при температуреол 70 -72 С на 5 ч. Через каждый ч наб 1 р- грева пробирки слегка взбалтывают. Послеэтого приборки охлаждают до комнатнойтемпературы, доводят уровень жидкостидо метки. К содержимому пробирок добавляют по 0,5 мл раствора диазотированного п-нитроанилина, взбалтывают иоставляют стоять на 1,5-2 ч, послечего колориметрируот при 435 им.После перевода показаний экстинкциив мкг алкилрезорцинолов с помощью калибровочной кривой (таблицы), рассчитываютих содержание в мг/кг зерна, пользуясь45 правилом пропорции,Данные о содержании 5-алкилрезорцинолов в зерне некоторых злаковыхкультур, полученные предлагаемым способом в сравнении с известным приведе 5 О ны в табл.3. покрытой ают уровень и погруоржениых в ряд (по убываюшей величине)зерен.Приготовление раствора диазотированного и-нитроанилина. Отвешивают на аналитических весах 60 мг п-нитроанилинаи переносят в пробирку, добавщпот 0,75 млконцентрированной НС 8, смесь подогревают до полного растворения п-нитроанилкна. После остывания добавляют 7,25 млводы.ОВ конической колбе па 200 мл растворяют 100 мг азотистокислого натрия(Йо МО) в 10 мл воды,К охлажденному на льду растворуЧокО в 200 мл колбе добавляют ло каплям в течение 20 мии) также охпажодщшый до +1-3 С раствор п-нитроанилинв НСК. Во время этой операции колба сраствором ЯОМСвсе время держитсяна льду и встряхивается. После окончаниприбавления колбу с диазотированными-нитроанилинсм оставляютнальду 30 минпосле чего к содержимому, добавляют.182 мп охлажденной воды, Раствор хранят в холодильнике.Пересчет показаний экстинкции(в мкг) алкилрезорцинолов производят покалибровочной кривой, построенной поорцину (метилрезорцин). Растворяют100 мкг орцина в 10 мл спирта. В пробирки берут 0,1:, 0,2, 0,3, 0,4 и 0,5 мраствора орцина доводят до 0,5 мл сп:томя прибавляют по 3 мл смеси этанолбутапол (1:1) и 0,5 мл диазотиро-,ванного и-щтроанилина. Колориметрируют через 1,5-2 ч при 435 нм,Микроспособ определения алкилрезцинолов. Для оценки селекшюпного материала на ранних этапах селекций насодержание алкилрезорцинолов, желано определять их количество в половике зерна, оставляя другую половинкудля посева.Важным является вопрос о том, равномерно ли распределение алкилрезорцинолов в разных частях зерна. Для этогокаждое зерно было рассечено на две полоВИнки и затем в пнх определялось сокдержание резорпинолов,Полученные данные (среднее из 10 зерен) приведены в табл. 2.Т аблица 2