Способ очистки микробной эстеразы

) Всесоюзный нау ео-исследоваособо чистых биопрепаратов; Вссследовательский институт био)де М ЮЗ СОВЕТСКИХИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИ СУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ ОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ С тельскии инстиесоюзный науч- технологии Алешина В.В ова Т.Ифедо- НОЙ ЭСТЕ(57) Сущность изобретения: после осаждения эстеразы из грубого экстракта сульфатом аммония без предварительного обессоливания ферментный раствор сорбируют на гидрофобном сорбенте в фосфатном буфере, содержащем (МН ) 30 40 -42 4 3596 насыщения, десорбцию эстеразы проводят после элюции балластных белков в том же буфере в градиенте концентрации (ЙН ) 50 от 20 - 15%42 4до 0 с последующей доочисткои на сефакриле 8 - 200. 3 табаИзобретение относится к биотехнологии, э именно к способу очистки эстеразы из Вас 11 цз зцЬ 1 з, которая может быть использована в химической, медицинской и микробиологической промышленности,Известно несколько способов выделения и очистки эстеразы Вэс 1 цэ эцЬОИэ 1 2 3)По способу (1) для получения гомогенного препарата экстракт фермента из клеток подвергают дробному осаждению сульфатом аммония, а затем очистке методом хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, ДЭАЭ-сефадексе, прогреванию в различных условиях, препаративному электрофорезу. Выход по активности указывается авторами лишь на промежуточных стадиях и составляет после ДЭАЭ-сефадекса 39 при степени очистки 16 раз, Многостадийность схемы очистки является недостатком данного аналога,В способе (2) фермент был очищен в 400 раз с использованием осаждения солями МпО 2, прогреванием, хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе и гель-хроматографией на В 1 о Баб Р, выход составил 590 , однако полученный фермент не гомогенный, что является серьезным недостатком данного аналога.Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому решению, который выбран авторами в качестве прототипа, является способ (3). По данному способу грубый экстракт клеток Вас 111 цэ зцЬсйз ДС(Г Е В М В Р) подвергают дробному осаждению сульфатом аммония, диализу, ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сеФарозе С 1:6 В, гель-хроматографии на СеФэкриле 3-200 и Сефадексе 0-150 и ионообменной хроматографии на С 1 АЕ-сеФадексе. Гомогенность эстеразы подтверждена методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ЮЯ),Недостатками данного технического решения является то, что для получения гомогенной эстеразы необходимо провести 5 стадий очистки, в результате чего выход фермента составляет лишь 9,9,Целью изобретения является упрощение технологии и повышение выхода конечного продукта,Поставленная цель достигается тем, что для получения гомогенного препарата используется культура Васйцз зцЬт 1 Из ЦМПМ В. После осаждения эстеразы из грубого экстракта сульфатом аммония без предварительного обессоливания ферментный раствор сорбируют на гидрофобном сорбенте в фосфатном буфере, содержащем сульфат аммония 40 - 350 насыщения, десорбцию эстеразы проводят после элюции балластных белков в фосфатном буфере в градиенте концентрации сульфата аммония от 20 - 15% до О, доочистку эстеразы проводят на Сефакриле 3-200.Авторами было найдено, что возможность существенного упрощения технологии достигается за счет улучшенной"О сорбции фермента при гидрофобной хроматографии по сравнению с ионообменной,это свойство фермента ранее в литературене описано. В результате появилась возможность ограничиться одностадийной очи 15 сткой. Существенным является выборэкспериментально обоснованных условийпроведения хроматографии на гидрофобном сорбенте, рН сорбции подбирают дляконкретного сорбента.20 Только совокупность взаимосвязанныхи взаимозависимых признаков обеспечивает положительный эффект, заключающийсяв эффективном способе получения гомогенной микробной эстеразы.25 П р и м е р 1, 40 мл грубого экстрактаклеток Васцз зцЬт 11 э ЦМПМ Всудельной активностью эстеразы ( активность эстеразы определяется колориметрически,субстратом является30 индофенилацетат) 4,0 ед/мг белка подвергают дробному осаждению сульфатом аммония 20(4,4 г с.а./40 мл) - 80(16,8 гс.а,/40 мл) от насыщения. Полученный осадок растворяют в 20 мл 0,02 М фосфатном35 буфере рН 7,5, содержащем сульфат аммония 400 насыщения и наносят на колонкуобьемом 55 мл с гидрофобным сорбентомВцику-ТЯК 650, уравновешенным тем же буфером, Элюцию балластных белков прово 40 дят 0,02 М фосфатным буфером с сульфатомаммония с 200 насыщения рН 7,5, Ферментдесорбируют градиентом сульфата аммония20 до 0 в 0,02 М фосфатном буфере, соскоростью элюции 16 мл.ч/см, собирают45 фракции обьемом 5,5 мл. Объединяют фракции, содержащие эстеразную активность,получают 30 мл раствора фермента. Этотраствор наносят на колонку объемом 800 млс сефакрилом 3-200, уравновешенным 0,1 М50 Фосфатным буфером рН 7,1. Фракции, содержащие эстеразу, объединяют, В результате очистки получили 60 мл раствораэстераэы с удельной активностью 400 ед/мгбелка и общим выходом 60%, Для храненияраствор лиофилизируют,П р и м е р 2-5 выполняют аналогично примеру 1, меняя условия сорбции на сорбенте Вцику-ТИК, условия проведения и полученные результаты приведены в табл.1.1839190 Таблица 1 Выход, % Сорбент Условия сорбции Условия десорбУдельнаяактивность, ед/мг белприии рн градиент концентсодержание сульфата аммония, % от насы ения мерации сульфатааммония,% от наров сы ения В оту-ТИК 20-0 7,5 40 35 38 33 42 400 380 390 250 240 60 58 59 40 35 20-0 7,5 20-0 7,5 7,5 20-0 20-0 7,5 СолозаКГ 20/ЗО20-0 5,3 40 40 320 280 210 200 56 54 27 5,3 7 8 9 10 15-0 5,3 10-0 40 40 5,3 25-0 30 Солоза КГ 8/24 5,1 20-0 300 40 50 П р и м е р 6. 40 мл грубого экстракта клеток ВасЬз зцЬОз Вс удельной активностью эстеразы 4,5 ед/мг белка подвергают дробному осаждению сульфатом аммония 20% - 80% от насыщения, Полученный осадок растворяют в 20 мл 0,02 М фосфатного буфера рН 5,3, содержащего сульфат аммония 40% насыщения, и наносят на колонку объемом 55 мл с гидрофобным сорбентом Солоза КГ 20/30, 10 уравновешенным тем же буфером. Злюцию балластных белков проводят 0,02 М фосфатным буфером с сульфатом аммония 20% насыщения рН 5,3. Фермент десорбируют градиентом сульфата аммония 20% до 0 в 15 0,02 М фосфатном буфере. Остальные операции проводят аналогично примеру 1. В результате очистки получили 60 мл раствора эстеразы с удельной активностью 320 ед/мг белка с общим выходом 56%. 20Г р и м е р 7 - 9, Выполняют аналогично примеру 6, меняя условия десорбции эстеразы на сорбенте Солоза КГ 20/30, данные приведены в табл.1,П р и м е р 10. Выполняется аналогично 25 примеру 1 на сорбенте Солоза КГ 8/24, условия проведения и полученные результаты приведены в табл.1.Из табл.1 следует, что наилучшие результаты по сорбции эстеразы на гидрофоб ном сорбенте получают при содержании в ф фатном буфере сульфата аммония от 40 - 35/, от насыщения. Десорбцию следует проводить в фосфатном буфере в градиенте концентрации сульфата аммония от 20-15% до О,В табл.2 приведены данные о степени очистки и выхода продукта на каждой стадии при минимальном значении удельной активности грубого экстракта,Гомогенность эстеразы показана методом электрофореза в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия. Основные параметры, характеризующие очистку по предлагаемому способу в сравнении с прототипом, представлены в табл,З.Таким образом, по предлагаемому способу в сравнении с прототипом в 5,6-6,0 раз увеличивается выход конечного продукта, сокращается количество стадий очистки при условии получения гомогенного фермента с 5 до 3.Кроме того, использование гидрофобных сорбентов вместо ионообменных после осаждения белка сульфатов аммония не тре" бует проведения предварительного обессоливания,(56) 1,Н 9 ега Т.В., ЯрЫлеп,. зоаоп оГ ьчо асееву езсегазе 5 гогп ех 1 гас 1 о 1 Вас,зцЬсз,. о 1 Ьассега, 1973 - 114, р.1184-1192.2.8 бег О.РН 9 ега Т,В, СЬагас 1 егзатоп о 1 мгасеШаг езсегазе А Ггогп Васоз зиЬз, ВВА- 429, р,191 - 197,З.ЕР М 0243167,кл. С 12 М 9/18, 1987.ол 190 Таблица 2 5 а а Формула изобретения осСПОСОБ ОЧИСТКИ МИКРОБНОЙ ЗС- В ТЕ РАЗЫ, предусматривающий дробное ос осаждение фермента сульфатом аммония ф из грубого экстракта клеток Вас 1 цз . а зцЬ 11 з и хроматографию с использованием сефакрил 8-200, отличающийся тем, ф что, с целью упрощения способа и повышения выхода целевого продукта, фермент аждают из грубого экстракта клеток ас 1 цз зцЬт 1 з ЦМПМ В, сорбцию уществляют на гидрофобном сорбенте в осфатном буфере, содержащем сульфат ммония 40 - 35 ф-ного насыщения, десорию эстеразы проводят в фосфатном буере в градиенте концентрации сульфата ммония от 20- 15 до 0 с последующей очисткой на афакриле 5 - 200. Сост Тех е итель В, АлешинаМ.Мо гентал Коо ект М,Демчик Редакт Заказ 340 Тираж Подписное НПО "Поиск" Роспатента113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производствен здательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101