Реактив для определения общего холестерина в сыворотке крови

Союз Советских Сощиалистическик Республик/О /1 арственный когтитСССРелам изобретенийн открытий.02.80, Бюллетень РЙ 3)Р 2315501.3 Опубликовано о 616-074 (088, 8) ата опубликования онисания 2 Ь 02.8 Иностранцы аус Бойкамп, Ханс Меллеринг, Гюн Грубер и Петер РешлауЛанг, Вол нг Иностранная фирмаБерингер Маннхайм Гм(71) Заявитель 4) РЕАКТИВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩЕГО ХОВ СЫВОРОТКЕ КРОВИ РИН 010 я определенияостоящий издигитонина,ангидрида ив определенпоз- олеХолестеринэстераза ХолестериноксидазаКаталаза Ацетилацето Метанол,05 1 0,1 10-0,4105 102,0-10,-6 -1 1Изобретение относится к областимедицины и может быть использованОпри диагностике различных заболеваний.Известен реактив длобщего холестерина, салкоголь-эФирной смесихлороформа, уксусногосерной кислоты, взятыхных количествах 1),Однако известный реактив неволяет точно определить общий хстерин в сыворотке крови.Целью изобретения является повышение точности определения,Это достигается тем, что реактивсодержит холестеринэстеразу, холестериноксидазу, каталазу, ацетилацетон, метанол, детергент и аммиачный буФер при следующем соотношениикомпонентов, вес.%." Детергент 2, -1,01АммиачныйбУФер ОстальноеДля реактива можно применять выделенную и обогащенную холестеринэстеразу, предпочтительно из микроорганизмов, Обогащение достигают путемдиализа, обработки слабо-основныманионитом и Фракционирования суль фатом аммония из сухого порошка изацетона микроорганизма или другогобиологического материала. Таким образом достигают 20-30-кратное обогащение холестеринэстеразы.15 В качестве слабо-основного .анионита пригодным является модифицированный диэтиламиноэтанольными группамк препарат на основе углеводов.При Фракционировании сульфатом аммония получают предпочтительно Фракцию .между 1,8 и 2,4 моля сульфатааммония. Полученную Фракцию Ферментазатем хроматографируютХорошие результаты получают, кого да микроорганизмы выращивают в питательной среде, содержащей сложные эфиры холестерина. При этом сложные эйиры.холестерина или смесь эфиров можно добавлять во время выращивания в ф качестве источника углерода или мож"но применять вместе с другими источниками углевода, Особенно предпочтительно применение микроорганизмов,которые получают по многостадийномуспособу выращивания, причем выращивание в первой стадии пооизводят напригодных источниках углерода (глицерин) и во второй стадии - на сложных эфирах холестерина. Реактив также может состоять изхолестериноксидазы, препарата холестеринэстеразы и производного гидразина, реаги)ующего с кетогруппами 5 О с образованием 1 идразона, а также буфера. В качестве проиэводноГо гидразина используют 2,4-динитрофенилгиЬраэин.Кроме того, реактив может дополнительно содержать растворители, стабилизаторы и поверхностно-активные вещества.Предпочтительно реактивы содержат следующие компоненты:1, ХолестериноксидазаХолес тери н эстераза измикроорганизма 0,05-0,5 мг . 65 13-150 ед,/мг Применение холестеринэстеразы изСапйЫа гцдова АМСС 14830 в слабокислой Форме, рИ 5-6,5 показываетвысокую стабильность. ОптимальноерН Фермента 7,5. Активность холестеринэстеразы повышается путем добавки поверхностно-активных веществ. 15Особенно предпочтительна добавка "гидроксиполиэтоксидодекана.Определение холестерина проис ходит Ферментацией при применениихолестеиноксидазы, но можно также 20применять холестериндегидразу илихолестериндегидрогенаэуферментативное определение общего или связанного холестеринаосуществляют с помощью холестериноксидазы, предпочтительно применяютхолестериноксидазу из ИосагйдаегуЮгоро 63.в ЛМСС 17895, ИосагЖаегу 1 Ьгоро 11 в АМСС 4277,Босагс 11 аЕогппса АМСС 14811 или Ргоасг 1 попусев З)егуЮ)гараев 1 В 9158.Предпочтительным реактивом является реактив, состоящий из холесте"риноксидазы, препарата холестеринэстеразы из микроорганизмов, каталазы, ацетилацетона, метанола и содержащего ионы аммония буфера, взятых по отдельности или в смеси,Реактив такжеможет состоять иэхолестериноксидазы, препарата измикроорганизмов с активностью холестеринэстеразы, пероксидаэы, хромогена и буфера вотдельности или всмеси, В качестве хромоъ.ена используют 2,2 -аминобензтиазолинсульфо(-;кислоту. .450,1-1,0 ед Каталаза 2 10"ф10 ед.Ацетилацетона 0,05-0,2 млМетанол 2-10 млв 100 мл буфена,содержащего ионы аммония, рН 5-7.Гидроксиполизтоксидодекан 0,02-0,3 мл 2,Холестеринок идаза 3-40 ед./мгХолестеринэстераза иэмикроорганизма 0,05-0,5 мгПероксидаза 2 10 -1 102,2-Амино- бензтиазолинсульфокислота 50-200 мгГидроксипо- лиэтоксидодекан 0,05-0,5 мл в 100 мл буфера с рН 6-8З.Холестерин-:оксидазаХолестеринэстераза измикроорганизма 0,05-0.,5 мг1 мм раствор2,4-динитрофенилгидразина 1-5 млПАВ 0,005-0,1 мл в 10 мп буфера с рН 6-8.4,Холестериноксидаза 2-100 ед.Холестеринзстераза измикроорганизма 0,05-0,5 мгПАВ (гидрокси- полиэтоксидодекан) 0,1-2,0 мл в 50 мл буфера с рН 5-9.С помощью предложенного реактива можно осуществлять быстрое и полное омыление связанного холестерина. Например, при условиях определения холестерина с помощью холестериноксидазы достигают количественное расщепление связанного холестерина в течение 1-3 мин при добавке сухого порошка из ацетона Сапс 1 Ыа гцдова АМСС 14830 или АврегдЛКив врес. ИЯ 90030 в количестве 0,1-0,3 мг.П р и м е р 1, В сыворотке крови определяют содержание свободного холестерина до 63 (63 мг в 100 мл) .Для определения связанного холестерина сравнительную пробу сыворотки крови обрабатывают в течение 30 мин спиртовым раствором едкого. кали при 70 С. После нейтрализации и нового измерения имеющегося холестерина получают общее содержание холестерина 181 мгВ. Получается, что 118 мг холестерина/ 100 мл находятся в связанной Форме.Способ с необработанной. сывороткой повторяют, но в начале определения добавляют 0,3 мг (по отношению к протеину) сухого порошка из ацетона СаЫЫа гцдова АМСС 14830 в стандартной Форме, Через 3 мин полярографи717994 65 ческое определение дает содержаниеобщего холестерина 183 мг .П р и м е р 2. Для повьюаенияактивности сложных эфиров холестерина стандартный сухой порошок изацетона СапйМа гцдоза АМСС 14830растворяют в буфере из Фосфата калия с рН 6,0 и диалиэуют по отношению к такому же буферу. После удаления лактозы, содержащейся в качестве стабилизатора, получают удельную активность холестеринэстеразы0,3 ед./мг протеина в диализованном растворе,Полученный раствор смешивают сионитом на основе декстрана, модифицированным диэтиламиноэтанольнымигруппами, ионообменник отделяют иэлюируют 0,2 М фосфатным буфером срН 6,0. В элюате получают удельнуюактивность холестеринэстеразы1,2 ед./мг.Полученный раствор подвергаютфракционированию сульфатом аммония.Выпавшую между 1,8 и 2,4 М сульфатааммония протеиновую фракцию отде-:ляют, Она показывает удельную активность холестеринэстеразы 2,5 ед./мг.Полученный продукт снова растворяют в фосфатном буфере с рН 6,0,диализуют по отношению к такому жебуферу вплоть до обесеоливаниЯ изатем хроматографируют через колонну,которая заполнена таким же анионитом, как указано выше. Опять проводят элюирование с помощью 0,2 Мфосфатного буфера с рН 6,0, Во фракции удельная активность холестерин-.эстеразы достигает 7 ед./мг протеина,Полученный обогащенный препаратхолестеринэстеразы применяют дляопределения холестерина, как описанов примере 1. Примененное колнчествосоставляет лишь 0,001 мг по отношению к протеину. Результаты соответствуют результату примера 1,Холестеринэстеразу из СапбЫагцдоза можно очистить обычным способом тонкослойиой хроматографией.Вместо стадий обогащения можно применить биохимические стадии очистки,например, осаждение или Фракционирование с помощью полиэтиленимина, органических растворителей или солей,хроматографии через материалы молекулярных сит или более слабые анионообменники с другими. Функциональиымйгруппами, чем диэтиламиноэтанольные. группы, осаждение с помощью протаминсульфата.Д р и м е р 3. К 0,5 мл сыворот(ки крови или стандартному холестерину добавляют 1,0 мл 0,5 М буФера наоснове фосфата калия с рН 7,5, котб"рый содержит 0,4 гидроксиполиэтоксидодекана и 2,5 ед./мг холестеринэстеразы, согласно примеру 2. Эту реакционную смесь инкубируютв течение 40 мин при 37 фС. Затем 60,25 мп этого раствора добавляют к3 мл реактива на холестерин, которыйсодержит две части уксусной кислоты,три асти уксусного ангидрида и однучасть серной кислоты (реактив Либермана-Бурхардта)При использовании стандарта в качестве относительной величины для типичной пробы найдено 170 мгобщегохолестерина. Сравнительное определение при омылении сложных эфиров холестерина спиртовым раствором едкогокали дает 165 мг ,П р и м е р 4, 0,02 мл сывороткикрови смешивают с 10 мл 0,5 М буферана основе фосфата калия, который со 15 держит 0,4 гидроксиполиэтоксидодекана и 0,2 ед/мг холестеринэстеразы,по примеру 2.Реакционный раствор инкубируют60 мин при 37 С. Затем высчитывают20 экстинкцию Ел при 240 нм в пригодном спектрофотометре и реакция начи-нается с помощью 0,1 ед/мг стериндегидразы из Вгеч 1 Ьас 1 ег 1 цв з 1 его 11 сцщ.Через 1.5 мин снова определяют экстин 25 кцию Е. Концентрация образовавшегося ь 4 -холестенона и вместе с этимхолестерина получается из разницымежду первым и вторым определениемс учетом молярного коэффициента30экстинкции для ь 4-холестенонапри 240 нм. Измерение типичного образца дает 183 мгобщего холестерина. Сравнительное определение спомощью холестериноксидазы (иэИосагй 1 а егу 1 йгоро 1;1 э) вместо стеЗ 5 риндегидразы дает 181 мгобщегохолестерина.П р и м е р 5. 10 г диаммонийгидрофосфата растворяют в 100 млводы и с помощью 85-ной фосфор 40 ной кислоты устанавливают рЯ 7,0.Затем добавляют 10 ед,/мг каталазы,С помощью полученного раствора смесьиз 0,2 мл ацетилацетона, 10 мп метанола и 0,1 г гидроксиполиэтоксидо 45 декана доводят до 100 мп. К этомураствору добавляют 2,5 ед,/мг холестеринэстераэы из кп 1 горцв врес.(ИВ 90027), 5 мл полученного раствора смешивают с 0,02 мл сывороткиили 0,02 мл стандартного раствора5 О холестерина с содержанием 200 мгхолестерина. Аликвотные части образца, содержащего сыворотку и такжестандарт холестерина, смешивают,с 0,1 ед/мг холестериноксидазы и инкубируют 60 мин при 37 С, Затемполученный краситель измеряют Фотометрически при 405 нм с учетом значений контрольных образцов.Содержание холестерина в содержао щем сыворотку образце составляет при использовании стандарта в качестве относительной величины 154 мгоощего холестерина. Контрольное определение с помощью холестеринэстеразы из Сапс 3 Ыа гцдова АМСС 14830вместо холестеринэстеразы из ВЬЫо717994 формула изобретения Составитель С, МалютинаТехред Н.Ковалева Корректор И.Муска Редактор В. Бер Заказ 9863/70 Тираж 673 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП Патент, г, Ужгород, ул. Проектная,4 рце врес. (ИЯ 90027) дает такое жезначение. Предлагаемый реактив повьыает точность определения общего колестерина в сыворотке крови. Реактив для определения общего холестерина в сыворотке крови, о т л и- о ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повыаения точности определения, он содержит холестеринзстеразу, холестериноксидазу, каталазу, ацетилацетон, метанол, детергент и аммиачный 15 буфер при следующем соотношении компонентов, вес,%:Холестеринзстераза 0,05 10 -б 10Холестериноксидаза 0,1 10 -б 10Каталаза 0,4 10 -10 10Ацетилацетон 5 10 0,2Метанол 2,0-10,0Детергент 2,0 10 -1,01Аммиачныйбуфер ОстальноеИсточники информации,принятые во внимание при экспертизе1 . Предтеченский В, Руководство по клиническим лабораторным исследованиям. М., 1964, с. 223-224,