Способ получения глицерин-дегидрогеназы

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК 09 4 з(59 С 12 Е ИЗОБРЕТЕНИ И АТЕНТУ ль (ФРГ В. дгодепев Ьу В 1 о 1 од. .1820 с 1 ейуйгодепея1 оду вв ер ни 1 ап,400. ЛУЧЕНИЯ Г 31 ИЦЕРИНоорганизмовпосредством ихания в содержапоследующей(54)(57ДЕГИДРО АегоЬасаэробно щей гли 1, СПОСОБ П ЕНАЗЫ из мик ег аегодепея о культивиро ерин среде с соб по п. я тем, ч дят биотин л и ч атательнуюентрации 3. Спо ю щ и й с среду вво 50 мкг/л. о в ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ(72) Петер Шталь, Ханс Зайди Хервиг Бруннер (Австрия)(71) Берингер Маннхайм ГмбХ(56) 1. 11 п Е.С., Мадаяап 1Асг.1 чаоп ой д 1 усего 1 дефупаве агою АегоЬас 1 ег аегос(евопоча 1 еп 1 са 1 опв,-Зогпа 1СЬев., 1960, ч. 235, М 6, р1823.2. Виггоп В.М. 61 усего 1депаве ггощ АегоЬасСег аегоИ 8724. - МеЮойя дп ЕпгувоЕЙ 1 гогя Я,Р.Со 1 оы 1 с 1,И.О.КаНею Лог)с, 1955, ч. 1, р.39 очисткой фермента путем экстракции клеток, Фракционирования сульфатом аммония и терйоинактивации примесных белков, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью увеличения об" разования целевого продукта в расчете на литр культуры, снижения продолжительности ферментации и получения Фермента со сниженной Кч для субстрата, в качестве микроорганизмов из вида АегоЬасгег аегодепея используют щтаммы АегоЬас 1 ег аегодепев РБМ 1643 или АегоЬасгег аегодепея МС 1 В 418, а после .завершения фазы логарифмического роста в процессе аэробного культивирования осуществляют анаэроб . ное культивирование.2. Способ по и. 1, о т л и ч аю щ и и с я тем, что в процессе ана эробного культивирования одят допо нительные количества глиц ина до достижения 1 его содержа я в среде, 1056909Изобретение относится к биохииической промышленности в частности к получению ферментных препаратов,и может быть использовано для энзиматического определения глицерина и его производных (после расщепления 5 последних до глицерина).Известен способ .получения глицерин-дегидрогеназы из микроорганизмов АегоЬасег аегодепез штамма 1033 путем их аэробного культивирования 10 на содержащей глицерин (0,2) среде с последующей очисткой фермента из экстрактов клеток. Культивирование проводят в течение 18 ч, а вьжод фермента составляет 57,5 ед/л . культуры, Среда культивирования не содержит биотин или дрожжевой экстракт. Величина КА для вйделения фермента не определена точно, но, исходя из значений активности при двух концентрациях субстрата, Км должна быть меньше, чем 1 10 М 1) .Недостатками способа являются необходимость длительного (не менее 18 ч) культивирования клеток, низкий выход фермента в расчете на литр культуры, а также низкая величина К для глицерина.Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения ЗО глицерин-дегидрогеназы из микроорганизмов АегоЬасег аегодепез посредством их аэробного культивирования в содержащей глицерин среде с последующей очисткой фермента путем экс тракции клеток, фракционирования сульфатом аммония и термоинактивации примесных белков. Культивирование микроорганизмов проводят при аэрации в течение 18-24 ч на среде с 1,5 щ глицерина. Выход фермента после культивирования в течвеие 24 ч составляет 8.3 ед/л среды(21Недостатками известного способа . являются низ кий выход Фермента в Расчете 45 на литр среды, необходимость длительного культивирования, а также получение фермента с высокой К(4 ФМ),свидетельствующий о невысоком сродстве фермента к субстрату. Последнее обстоятельство не позволяет эффективно использовать полученную глицерин-дегидрогеназу для энзиматического определения глицерина при низких концентрациях последнего.Целью изобретения является увеличение образования целевого продукта в расчете на литр культуры, снижение продолжительности ферментации и получение фермента со сниженной К для субстрата, 60Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения глицерин-дегидрогеназы из микроорганизмов АегоЬас 1 ег авгодепез посредством их аэробного культивирования в . содержащей глицерин среде с последующей очисткой фермента путем экст. ракции клеток, функционирования суль фатом аммония и термоинактивации примесных белков, в качестве микроорганизмов из вида АегоЬасег аегоцепез используют штаммы АегоЬас 1 ег аегоуепез РВМ 1643 или АегоЬасгег аегоуепез ИС 1 В 418,а после завершения фазы логарифмического роста в процессе аэробного культивирования осуществляют анаэробное культивирование.В процессе анаэробного культивирования вводят дополнительные количества глицерина до достижения 1 его содержания в среде.Кроме того, в питательную среду вводят биотин в концентрации 50 мкг/л.Использование микроорганизмов АегоЬасег аегоуепез штаммов РБМ 1643 или ИС 1 В 418 позволяет значительно увеличть выход глицерин-дегидрогеназы по активности (не менее, чем в 10 раз) даже при исполь зовании известных способов культивирования и выделения фермента, Предложенная в изобретении последовательность культивирования - сначала аэробные условия с подводом кислорода или кислородсодержащих смесей в течение фазы логарифмического роста, а затем анаэробные условия, позволяют получить фермент с большим выходом, чем при чисто анаэробных условиях. Увеличение образования глицериндегидрогеназы происходит также при введении на стадии анаэробного куль тивирования дополнительных количеств глицерина, т.е. количеств болы".их, чем потребляется микроорганизмами. Предпочтительно также вводить в среду культивирование биотин в концентрации 50 мкг/мл вместо дрож- жевого экстракта.При культивировании в указанных условиях за 6-8 ч ферментации достигается максимальное содержание Глицерин-дегидрогеназы, причем окончание культивирования может быть определено по начинающемуся снижению Рн среды. Выход фермента составляет при этом 3000-9000 ед/л среды. Величина К у выделенного фермента состав,ляет 6,6 10 фМ.Выделение фермента из биомассы микроорганизмов проводят после разрушения клеток ультразвуком и последующего отделения растворимого фермента с помощью центрифугирования. Экстракт клеток фракционируют сульфатом аммония. Примесные белки выпадают в осадок при насыщении 35, а глицерин-дегидрогеназы - при доведении насыцения сульфатом аммония до 45. Содержащий глицерин-дегидрогеназу осадок растворяют в буфере и нагревают при 60 С в течение 4 мино1056909 Составитель В.МуронецРедактор Н. Рогулич Техред Л.Микеш Коррек тор .А, Зимокосов Заказ 9369/59 тираж 523ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Подписное филиал ППП Патент, гУжгород, ул. Проектная, 4 для денатурации примесных белков, которые отделяют цен трифугирован ием. Удельная активность очищенного фермента - 20 ед/мг белка.П р и м е р 1. Микроорганизмы АегоЬасгег аегоуепеэ штамма РСМ 1643 культивируют в среде, содержащей,%: пептон из каэеина 0,8; мясной пептон 0,8; К 2 НРО 4 0,3;(МН 4)НРО 4 0,2; БаСР Об; глицерин 1; биотин 50 мкг/л рН 7,0. Культивирование проводят при 10 37 С, продувании воздуха и перемеошивании в 10-литровом Ферменте. В Ферментер подают 300 л воздуха в час до окончания фазы логарифмического роста. Интенсивность перемешивания 15 300 об/мин.При завершении фазы логарифмического роста прекращают доступ воздуха и начинают добавление глицерина. При этом концентрация глицерина возрастает от 0,3 до 1,0 при окончании ферментации, протекаицей за б ч.Количество полученной биомассы составялет 10 г/л, а активность глицериндегидрогеназы - 9000 ед/л.Полученную суспенэию культуры обрабатывают в аппарате, генерируюцем ультразвук, в течение 3 мин. Разру шенные клетки центрифугируют для отделения нерастворимых компонентов и определяют активность глицерин дегидрогенаэы в надосадочной жидкости.Для дальнейшей очистки экстракт фракционируют сульфатом аммония, доводят насыщение раствора сульфа том аммония до 35 и отделяют баластные белки центрифугированием, затем доводят насыщение до 45 и отделяют осадок, содержащий глицерин-дегидрогеназу. Осадок фермента растворяют в 0,1 М Фосфатном буфе 1 ре с рН 7,0, содержащем 0,85 МыСЯ. Раствор нагревают при 60"С в течение 4 мин для инактивации примесных белков,. которые отделяют центрифугированием. Прозрачный раствор содержит глицерин-дегидрогеназу с удельной активностью 20 ед/мг и Кщ для глицерина 6,6 (О 4 М.Актив ность глицерин-дегидрогеназы определяют спектрофотометрически при 366 нм по образованию НАДН в ходе ферментативной реакции. Реакционная смесь общим объемом 3,05 мл содержит 2,65 мл буфера с рН 10 (0,12 М МаНСО и 0,04 М (МН 4)804), 0,1 мл 1 0 М раствора НАД, 0,1 мл 1,5 М раствора глицерина и 0,1 мл экстракта или раствора фермента, разведенного в соответствии с его активностью. Реакцию начинают добавлением глицерина.П р и м е р 2. Культивирование и выделение Фермента проводят,как описано в примере 1, но в качеетве микроорганизмов используют штамм АегоЬасгег аегодепеэ ИС 1 В 418 (обозначаемый также как Еп 1 егоЬас-.1 ег аегодепез). Длительность культивирования составляет 8 ч. Активность глицерин-дегидрогеназы 4000 ед/л культурыПрименение предлагаемого способа позволяет в 50-100 раз увеличить выход глицерин-дегидрогенаэы в расчете на литр культуры, снизить время культивирования в 3-4 раза, а также получить фермент с величиной Км б,б (О 4 М, которая в 60 раз ниже, чем величина Км при других способах получения глицерин-дегидрогеназы. Получение глицерин-дегидрогеназы с более низкой величиной Кя, позволяет более эффективно использовать этот фермент, особенно, в аналитических целях.