Способ получения полинуклеотидлигазы, индуцируемой фагом т4 в клетках

(23) Приоритет -Опубликова заявкиГосударственный комитет СССР по делам изобретений и открнтий300479,Бюллетень %16 а опубликования описания 300479 А.С.Солонин Институт ми СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДЛИГАЗЫ,ИНДУЦИРУЕМОИ ФАГОМ Т 4 В КЛЕТКАХЕБСНЕВЭ.СН 3.А СОИ репарата ДНК-лига я к способамименно к спочищенныхдят применеэкспериментах туры и функой ины. в емого изобретенивыхода целевогочистки и упрощепредполага повышение степени о есса, Цель являетс продукт ние про указанная цель, достигается ,что экстракт Е.со 2 В, зараженныйФагом Т 4 ат Й 82, фракционированныйрастворами сульфата стрептомицина,сульФата аммония, хроматографируют ндвух соединенных последовательномежду собой колонках с ДЕАЕ-целлюлозой и фосфоцеллюлозой (Р-П 1 с после"дующей хроматографией на двух последовательно соединенных колонкахс ДЕАЕ-целлюлозой и ДИК-агарозой.Концентрирование элюата осуществляютпереосаждением сульфатом аммония илис помощью небольшой колонки с Фосфоцеллюлозой Р-П, Выход целевого продукта 10. Удельная активность полученного этим способом препарата фермента 15000 ед/мг белка. За единицуактивности принимается количествофермента, необходимого для переводав резистентную к экзонуклеазе Ц Форму 100/4 М поли(А-Т) при 37 о за30 мин,ции ДНК.Наиболее близкий пс степени очистки препарат фермента получается при применении метода, предложенного0 Рапе 1 А. с соавторами. В этом способе в качестве источника Фермента используется экстракт клеток Е.сот,1 В зараженных Фагом Т 4 ат й 82, который освобождают от обломков клеточных стенок центрифугированием. Белки неочищенного экстракта фракционируют сульфатом стрептомицина, сульфатом аммония, диализуют против буферного раствора, затем проводят фракционирование и хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе, хроматографию на фосфоцеллюлозе и гидроксилаппатите и концентрирование препарата фермента, Выход -2-4% активность до 10000 ед/мг белка 11 .Недостатком этого метода является низкий выход целевого продукта, наличие большого количества трудоемких стадий,что очень замедляет выделение фермента и приводит к значитель- З 0 Изобретение относит получения ферментов, а собам получения высоко ДНК-лигаз, которые нах ние в генно-инженерных и в исследованиях струк.Глухов, В.И.Таняшин и Ь.А.Бае физиологии микроорганизмов АН СССР6596Ца отсутствие зк зснуклеаз указывает полное сохранение концевой дезоксинуклеотидной последовательностипри длительных инкубациях (60 час)больших количеств фермента с ДНК.Препарат Фермента совершенно свободен от эндонуклеаз, не понижает уровня биологической активности ДНК притра нсфек ции.П р и м е р . Е.со 1 В выращиваютдо титра 6-7 х 10 бактериальных телв мл при 37 С с интенсивной аэрацией на среде следующего состава (г на1 л): й Н 4 СЕ -1, МБО, - 0,13,КНР 04 - 3, М аНРО 4 - 6, глюкоза - 4,.казаминовые кйслоты - 2. Заражаютфагом Т 4 ае М 82 с множественностью 5 (5фаговых частиц на клетку и продолжают выращивание в течение 1,5-2 час,Зараженные клетки собирают центриФугированием. Все дальнейшие операции проводят на холоду (О +5 С), вовсех буферных растворах присутствует10 п М трис-НС 1 рН 7,5 и 10 п М-меркаптоэтанола (А), клетки (100 г)дезинтегрируют, белки экстрагируютбуфером Л и освобождают экстрактот разрушенных клеточных стенок центрифугированием. Экстракт осаждают0,6-0,73 сульфатом стрептомицина,центрифугируют. Осадок отбрасывают,Супернатант осаждают сульфатом аммония при 30 насыщения. Осадок отбрасывают. Супернатант осаждают, доводяконцентрацию сульфата аммония до55 насыщения, Осадок растворяютв буфере Л с 0,1 М ИаС 3 и диализуютпротив буфера А. 35Посадку на соединенные последовательно колонки с ДЕЛЕ-целлюУюзой(100 мп) и фосфоцеллюлозой (50 мл)проводят в буфере с 0,2 М МаС 0 т.е.в условиях, когда фермент связывается лишь со вторым ионообменником(фосфоцеллюлозой), и элюируют, ступенчато повышая концентрацию йаС 3.Фракции элюата, содержащие ДНК-лигазу, диализуютпротив буфера А в течениеночи. Затем проводят хроматографию на совмещенных колонках сДЕЛЕ-целлюлозой (100 мл) и 10 мп ДНК 14 4агарозой (однонитевая ДНК, выплавленная в агарозу), Элюацию проводят градиентом концентрации ИаС 1 в буфер А сразу с обоих сорбентов. Применение ионообменников в такой последовательности позволяет резко сократить их объем. ДНК-агароза прочно связывает многие нуклеазы и эффективно очищает препарат фермента. Элюат, содержащий ДНК-лигазу, концентрируют с помощью колонки гидроксилаппатита (1-2 мл) или переосаждают сульфатом аммония. Полученный препарат фермента диализуют против 60-ного глицерина в буферном растворе А.Предлагаемыйспособ позволяет получить препарат фермента с 10-15% выходом. Препарат фермента имеет 15000 ед/мг белка и свободен от нуклеаз.Сокращено число операций и время выделения за счет соединенных колонок в определенной последовательности.,Формула изобретенияСпособ получения полинуклеотидлигазы, индуцируемой Фагом Т 4 в клетках ЕВСЬЕгСЬа соПпредусматривающий заражение клеток фагом, дезинтеграцию клеток, экстракцию, центриФугирование экстракта с последующим осаждением сульфатом стрептомицина, а затем сульфатом аммония, диализом и хроматографией раствора, содержащего фермент; по окончанию которой раствор концентрируют с помощью колонки гидроксилаппатита, о т л и - ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода фермента, степени очистки и упрощения процесса, хроматографию проводят сначала ва соединенных последовательно колонках с ДЕАЕ-целлюлозой и фосфоцеллюлоэой, а затем на колонках с ДЕАЕ-целлюлозой и ДНК-агарозой.Источники информации, принятыево внимание при экспертизе1.В 1 оспещЫгу1973, 12, .р.5045.Составитель А.СолонинРедак тор Н. Грязнова Техред О.Андрейко, Корректор О. БилакЗаказ 2120/б Тираж 525 ПодписноеПНИИНИ, Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035 Москва ЖРа ская наб. д.4/5ь х Н сФилиал ППП Патент, г,ужгород, ул.Проектная,4