Способ получения щелочной фосфатазы

(51) 5 СО 103 СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТ 111 ЕСКПХ РЕГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТВЕДОМСТВО СССР (ГОСПА ПУБЛИК1 тпОе ТЕНТ СССР 1 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН К АВТОРСКОМУ С ЕЛЬСТВУ 201/139093 Бюп. Ма 45-46о-исследовательская лаборатория биоактивных веществ гидробионтовов И.ЮСтепанова И.Е,СОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЩЕЛОЧНОЙ ФОС(21) 4787 (22) 30.01 (46) 15.12. (71 Научн логически (72) Сахар (54) СПО ФА ТАЗЫ (57) Изоб - повыше щение спо препарат етение относится к биотехнологии, Цель ие удельной активности фермента, упрособа и увеличение выхода. Ферментный щелочной фосфатазы получают гомогенизациеи т н-бутаноло концентрац разделение ных антите ня, продуци руемых кле ние провод активность 20800 ед/ онкого кишечника тюленя, экстракциеи м, осаждением этанолом при конечной ии 55 - 65 об.% и хроматографическим м на иммобилизованных моноклональлах против щелочной фосфатазы тюперуемых штаммом гибридных купьтивиток АРР.1.ВКК(П) 377, причем элюироваят растворами с рН 95 - 11,5. Удельная щелочной фосфатазы равна 19000 - мг белка. Выход ло активности равен 90,. очищенной щелочной фосфатазы животногопроисхождения, которая находит применение в генной инженерии, иммуногистохимических процедурах и иммуноферментном 5анализе, научно-исследовательской работе,Известна хроматографическая очисткащелочной фосфатазы на ионообменниках,несущих диэтиламиноэтильные и фосфатные группировки. Однако получаемый продукт обладает низкой активностью, чтосужает область его использования, Болееперспектйвным, методом очистки являетсяаффинная хроматография. Одним иэ примеров аффинной хроматографии является иммуносорбция на иммобилизованныхантителах против щелочной хроматографиина нерастворимых лектинах, Используя тотфакт, что щелочная фосфатаза животногопроисхождения является гликопротеидом, 20для очистки щелочной фосфатазы был применен иммобилиэованный конканавалин А.Хотя последние два способа имеют очевидные преимущества перед остальными,удельная активность целевого продукта недостаточно высока и не превышает 2000 ЗООО единиц. на 1 мг белка. Разумнымсочетанием известных приемов можно повысить эту величину,В качестве прототипа выбран способ 30получения щелочной фосфатазы, которыйпозволяет получить наиболее высокуюудельную активность целевого продукта,Данный способ .включает следующиеоперации; печень быка отмывали от крови 350,9%-ным раствором йаС и гомогенизировали в 100 мМ трис-НС, рН 7,6, содержащем 1 мМ СаС 2, 1 мМ М 9 С 2, 0,02 мМ Еп 804и 1 мМ МпСз, К гомогенату добавляли рав. ныйобъемохлажденногодоСн-бутанала при постоянном перемешивании. Попрошествии 40 мин смесь центрифугировали, к водному раствору добавляли ацетон(-20 С) до его конечной концентрации 30;5.После центрифугирования осадок отбрасывали, а концентрацию ацетона в раствореповышали до 50;6. Осадок растворяли в 100мМ трис-НС, рН 7,6, содержащем 1 мМСаС 2 1 мМ М 9 С 2 О 02 мМ Еп 304 и 1 мММпС 2 и наносили на колонку с сефадексом 506-150, Белок, обладающий фосфатазной активностью, очищали затем на колонке с ОЕНугелем. В дальнейшем щелочнуюфосфатазу смешивали с конканавалин А-сефароэой4 В, а фермент элюировали с.помощью а-метил-О-манопираноэида, Дальнейшая очистка щелочной фосфатазы включалаионообменную хроматографию на моно 0колонке (Нй 5/5) и высокоэффективную обратнофаэную хроматографию на дифенилкремнеземе (размер пор 50 нм). В результате получили препарат щелочной фосфатазы с удельной активностью 7440 единиц на 1 мг белка; выхода 7-стадийной очистки составил 10,Недостатком известного способа является невысокая удельная активность целевого продукта. Кроме того, существенным ограничением данного метода является его многостадийность и низкий выход.Целью предлагаемого изобретения является повышение удельной активности препарата щелочной фосфатазы, упрощение способа и увеличение выхода.Поставленная цель достигается тем, что ферментный препарат получают гомогенизацией тонкого кишечника тюленя, после экстракции н-бутанолом осаждают этанолом при конечной концентрации 55-65 об,0, хроматографическое разделение осуществляют на иммобилизованных моноклональных антителах против щелочной фосфатазы тюленя, секретируемых гибридными клетками АРР.1, причем элюирование проводят растворами с рН 9,5-11,5.В предложенном способе активность целевого препарата щелочной Фосфатазы увеличивается до 19000-20800 единиц на 1 мг белка при одновременном сокращении числа стадий до трех и повышении выхода до 90-9400.Верхняя граница конечной концентрации этанола при осаждении 65 об.; обусловлена тем, что при более высокой концентрации этанола, когда вся фосфатаза уже осаждена, происходит осаждение балластных белков, что приводит к уменьшению степени очистки.Нижняя граница конечной концентрации этанола при осаждении 55 об.% обусловлена тем, что при более низкой концентрации зтанола значительная часть фосфатазы остается в растворе, что приводит к уменьшению выхода.Верхняя граница рН элюции обусловлена тем, что при рН 11,5 наблюдается количественная десорбция фермента с иммуносорбента, а дальнейшее повышение рН только приводит к денатурации как фермента, так и иммобилизованных антител.Нижняя граница рН элюции обусловлена тем, что при рН ниже 9,5 резко понижается степень десорбируемости фермента с иммуносорбента, что приводит соответственно к низкому выходу очистки целевого продукта.Предлагаемый способ заключается в следующем; 25 г свежезамороженного тонкого кишечника тюленя раэмельчают и гомогенизируют в 25 мл 0,05 М трис-НС, рН17132657 ,4, содержащем 2,5 мМ МдЯО ь. К гомогена- деляли ферментативную активность по отту добавляют 80 мл н-бутанола ьь проводят ношению к и-нитрофенилфосфату и коноэкстракцию при 37 С в течение 1,5 ч. Буга- центрацию белка по Лоури. Данный способнольнуюфазуотбрасывают, а 45 мл водного позволяет получать препараты щелочнойраствора диализуют против 1 л 0,05 М трис фосфатазы с удельной активностью равнон иНС, рН 7,4, содержащего 2,5 мМ Мд 304, в 19000 ед/мг белка, выход по активности ратечение 20 ч при 4 С, Буфер заменяют све- вен 90 о .жим через 10 ч. К полученному диализатупри перемешивании добавляют этанол (4 С) П р и м е р 2. 25 г свежезамороженногодо конечной концентрации 55 - 65 об.о , вы тонкого кишечника тюленя размельчали идерживают 30 мин при 4 С и осадок центри- гомогенизировали в 25 мл 0,05 М трис-НС,фугируьот. Полученный осадок растворяют в рН 7,4, содержащем 2,5 мМ М 9304. К гомо 20 мл 0,02 М трис-НС рН 7,4, содержащем генату добавляли 80 мл н-бутанола и прово 10 мМ МдС 2 и 0,5 М ИаС. Раствор наносят дили экстракцию при 37 ОС в течение 1,5 ч.на колонку (Ч=10 мл) с иммобилизованны Бутанольнуюфазуотбрасывали, а 45 мл водми моноклональными антителами, секрети- ного раствора диализовали против 1 л 0,05руемыми гибридными клетками АРР,1, м трис-НС, рН 7,4, содержащего 2,5 мМ(коллекция клеточных культур Института ци- МдЯО, в течение 20 ч при 4 С. Буфер заметологии АН СССР, Ленинград, номер 377 Д), няли свежим через 10 ч, К полученному дипредварительно уравновешенными тем же 20 алиэату при перемешивании добавлялибуфером. После нанесения фермента гель этанол (4 С) до конечной концентрации 65отмывают 0,02 М трис-НС, рН 7,4, содержа- об,%, выдерживали 30 мин при 4 С и осадокщим 10 мМ МдС 2 и 0,5 М йаС, до А 2 во, центрифугировали.Полученныйосадокрасравной 0,03-0,05. Фермент элюируют рас- творяли в 20 мл 0,02 М трис-НС, рН 7,4,творами с рН 9,5-11,5. Активные фракции 25 содержащем 10 мМ МдС 2 и 0,5 М йаС.объединяли и определяли ферментативную Раствор наносили на колонку (ч 10 мл) сактивность. Данный способ позволяет пол- иммобилизованными моноклональными. учать препараты щелочной фосфатазы с антителами, секретируемыми гибриднымиудельной активностью, равной 19000-20800 клетками АРР,1 (коллекция клеточных кульед/мг белка; выход по активности равен 90- 30 тур Института цитологии АН СССР, Ленинг 94%. рад, номер 377 Д), предварительноП р и м е р 1. 25 г свежезамороженного уравновешенными тем же буфером. Послетонкого кишечника тюленя размельчали и нанесения фермента гель отмывали 0,02 Мгомогенизировали в 25 мл 0,05 М трис-НС, трис-НС 1, рН 7,4, содержащим 10 мМ МдС 2рН 7.4, содержащем 2,5 мМ МдЯО ь, К гомо и 0,5 М ИаС, до А 2 во, равной 0,03-0,05. Фергенату добавляли 80 мл н-бутанола и право- мент элюировали 0,5 М триэтиламином, рНдили экстракцию при 37 С в течение 1,5 ч. 11,5. Активные фракции объединяли и опреБутанольнуюфазуотбрасывали,а 45 мл вод- деляли ферментативную активность по отного раствора диализовали против 1 л 0,05 ношению к и-нитрофенилфосфату иМ трис-НС 1, рН 7,4, содержащего 2,5 мМ 40 концентрациюбелкапоЛоури.ДанныйспоМ 9304, в течение 20 ч при 4 С, Буфер заме- соб позволяет получать препараты щелоч. няли свежим через 10 ч. К полученному ди- ной фосфатазы с удельной активностью,ализату при перемешивании добавляли равной 19460 ед/мг белка; выход по активэтанол (4 ОС) до конечной концентрации 55 ности равен 91%,об,%,выдерживали 30 минпри 4 Сиосадок 45центрифугировали. Полученный осадок рас- . П р и м е р 3. 25 г свежезамороженноготворяли в 20 мл 0,02 М трис-НС, рН 7,4; тонкого кишечника тюленя размельчали исодержащем 10 мМ МдС 2 и 0,5 М МаО. гомогенизировали в 25 мл 0,05 М трис-НС,Раствор наносили на колонку (Ч=10 мл) с рН 7,4, содержащем 2,5 мМ Мд 304. К гомоиммобилиэованными моноклональными ан генату добавляли 80 мл н-бутанола и провотителами, секретируемыми гибридными дили экстракцию при 37 С в течение 1,5 ч.клетками АРР,1 (коллекция клеточных куль- Бутанольную фазу отбрасывали, а 45 мл водтур Института цитологии АН СССР, Ленинг- ного раствора диализовали против 1 л 0,05рад, номер 377 Д), предварительно М трис-НС, рН 7,4, содержащего 2,5 мМуравновешенными тем же буфером, После 55 М 9304, в течение 20 ч при 4 С, Буфер заменанесения фермента гель отмывали 0,02 М няли свежим через 10 ч. К полученному дитрис-НС, рН 7,4, содержащим 10 мМ МдС 2 ализату при перемешивании добавлялии 0,5 М йаС,доА 2 во, равной 0.03-0,05, Фер- этанол (4 С) до конечной концентрации 60ментэлюировали 0,05 М триэтиламином, рН об.% выдерживали 30 мин при 4 С и осадок9 5. Акти,5. Активные фракции объединяли и апре- центрифугировали. Полученный осадок рас8 1713265 Составитель Н.АфанасьеваТехред М.Моргентал Корректор Н. Милюкова Редактор Тираж Подписное НПО "Поиск" Роспатента113035, Москва. Ж, Раушская наб., 4/5 Заказ 3353 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.гагарина, 101 творяли в 20 мл 0,02 М трис-НС 1, рН 7,4, . содержащем 10 мМ МЫС 2 и 0,5 М ИаС.Раствор наносили на колонку (ч - 10 мл) с иммобилизованными моноклональными антителами, секретируемыми гибридными клетками АРР.1 (коллекция клеточных культур Института цитологии АН СССР, Ленинград, номер 377 Д), предварительно уравновешенными тем же буфером. После нанесения фермента иммуносорбент отмывали 0,02 М трис-НС 1, рН 7,4, содержащим 10 мМ М 9 С 12 и 0,5 М МаС 1, до Арво равной 0,03-0,05. Фермент элюировали 0,05 М триэтиламином рН 10,3. Активные фракции обьединяли и определяли ферментативную активность по отношению к и-нитрофенилфосфату и концентрацию белка по Лоури, Данный способ позволяет получать препараты щелочной фосфатазы с удельной акФормула изобретенияСПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ, предусматривающий гомогенизацию сырья животного происхождения, экстракцию н-бутанолом, осаждениеорганическим растворителем и аффинную хроматографию, отличающийся тем, что, с целью повышения удельной активности фермента, упрощения способа и увеличетивностью. равной 20800 ед/мг белка; выход по активности равен 940/.Таким образом, технико-экономическийэффект предлагаемого способа заключается в 5 увеличении активности целевого продукта -щелочной фосфатазы, резком сокращении стадий очистки и повышении выхода, Это позволяет создать простой и легко масштабируемый процесс выделения и очистки щелоч ной фосфатаэы тюленя при небольшихзатратах материалов, рабочегоитехнологического времени и сырья.(56) Авторское свидетельство СССР15 В 1426089, кл. С 12 й 9/16, 1986.Авторское свидетельство СССРМ 1554377, кл, С 12 й 9/16, 1988.1 оа . - Сбагао 1 п 1 ЕРап У. - С,Е, ела.АгсИ, Вос 6 ев. Вормуз., 1985, ч, 241, р,20 380-385 - прототип,ния выхода, в качестве сырья-используют тонкий кишечник тюленя, осаждение ведут этанолом при конечной концентрации 55- 65 об аффинную хроматографию осуществляют на иммобилизованных моноклональных антител ах, продуцируемых 30 штаммом гибридных культивируемых клеток АРР.1 ВКК (П) Д 377, а элюирование проводят раствором с рН 9,5- 11,5.