Способ получения меченных т моноклональных антител

.Ь См рг, Фф :фССДЗ ССНЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ - РЕСПУБЛИК ГОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(72) Карл-Хайнц Бремер, ЛюдвигКульманн, Александер Шварци Акссль Штайнштрэсер (ЭЕ)(56) Патент СНА й 4478815,кл. А 61 К 43/00, опублик. 23.10.84,(54) СПОСОБ ПОЛУ 1 БНИЛ МЕДЛЕННЫХ ТсМОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ(57) Изобретение относится к радиоим-мунологии и касается способа получе-,ния меценныхфтс моноклрнальных Изобретение относится к медицине,а именно к радиоиммунологии, и касается способа получения меценныхфф Тс моноклональных антител.Целью изобретения является повы",шение качества введения метки.П р и м е р 1. 20 г направленногопротив карцино-эмбрионального анти-гена (СЕА) моноклонального антителаВИ 431/31, которое находит применениедля диагностического обнаруженияколоректальных карцином, при комнатной температуре путем диализа осво"бождают от добавок (таких как сахароза) и переводят в изотоницеский раствор хлорида натрия,ЯО 1711657 А 3 2антител. Целью изобретения является повышение качества введения метки, Смешивают тс пертехнетат и раствор предварительно обработанного моноклонального антитела или их Р(аЬ) -Фрагмента в присутствии солей олова.В качестве солей оловаиспользуют соли оловаметандиФосфоновой кислоты или.33-дифосфонопро пионовой кислоты, или 3,3-дифосфоно 1,2-пропандикарбоновой кислоты или пропан,1,3,3-тетрафосфоновой или пирофосфоновой кислоты. На 1 мг белка антитела добавляют 5-10 мкг соли олова. Использование предлагаемого способа позволит повысить прочность .мецения Тс моноклональных антител или их Г(аЬ ) -Фрагментов.3 табл. Имеющееся затем в концентрации примерно 5 мг/мл антитело вводят во взаимодействие с 20 мг 2-меркаптоэтанола при комнатной температуре (30 мин) и после этого путем гель- фильтрации на. биогеле Р"2, полиакрил-, амидном геле Фирмы .БИО РА/, отделя" ют от избыточного восстановителя.; Растворенное в 0,02 И Фосфатном буФере (рН 7,2) антитело сразу отделяют и лиофилизируют. Высушенные путем вымораживания пробы содержат на дозировку 2 мг антитела и примерно 1,4 мг динатрийгидрофосфата.Для мечения технециемш пробы вводят во взаимодействие с 7,5 мл раствора пертехнетата (примерно3000 ИВ ц)В качестве олово-компо-ненты используется лиофилиэированная метящая единица, состоящая из 5 мг натриевой соли 3,3-дифосфонопропионовой кислоты 01 мг катионов оло ваи 0,5 мг Б-(ч-аминобензоил)-1- . глутаминовой кислоты. Эту смесь растворяют в 5 мл Физиологического раствора хлорида натрия и затем до- О бавляют (спустя 1 мин) 0,5 мл этого раствора к раствору антитела до общего объема 8 мл, После 10-минутной реакции путем тонкослойной хроматографии, гель-Фильтрации на биогеле 15 Ри жидкостной хроматографии высокого давления на ЕогЬах СРфирмы Дюпон определяют выход меченного мТс антитела,в которой свыше 956 технециям свя зыва ется с протеином, пример- ю но 14 находится в виде связанных с Фосфонатом частей и менее 14 пертехнетата. Доля пертехнетата снова возрастает лишь при более продолжитель" ном периоде выдерживания, спустя 25 6 ч приблизительно составляет 24, в то время как связанная с фосфонатомчасть остается неизменной (13).Определение иммунореактивной долив различных меченных технециемм антителах путе измерения связывания с клетками опухолей даст хорошо совпадающие значения для иммунореактивности с соответствующими меченными, иодоми индиемСБА-антителами, данные приведены в табл.1.1П р и м е р 2. Для мечения Тснаправленного против ассоциированно-.го с карциномой поджелудочной железы Ииссз-антигена, моноклональногоантитела ВЫ 494/32, 20 мг этого вещест,ва,растворенные в 2 мл изотоническогораствора хлорида натрия, инкубируют с0,5 мл 1 О-ного водного раствора цис" теамингидрохлориде а течение 20 минпри комнатной температуре. Очищенноес помощью колоночной хроматографии модифицированное антитело, растворенное в 0,02 И буферном растворе БаНРО 4, 0лиофилиэируют порциями по 2 мг, Вкачестве олово-компоненты для ,мечения технецием антитела используют метящий набор с пирофосфатом, который сожержит 7, мг На 4 Ра 07 " 551,03 мг хлорида олована набор.Содержимое дозировки (упаковки) растворяют в 10 мл Физиологического раствора хлорида натрия и 0,25 мл (примерно 4 мкг Яп ) этого раствора добавляют к антителу, которое предварительно растворено йримерно в 8 млраствора пертехнетата (примерно2000 ИВ 1). После 10-минутной реакции 11,1 мл раствора следующего состава, мкг: ваЪ 25, Ба 4 Р 07 2,25, оло-воО,75, буфер ИаНРО 4, вводятвнутривенно здоровым крысам. Распределение по органам спустя 2 М ч после.инъекции показано в табл.2. Из данных табл.2 следует, что накопления в костях, щитовидной железе и желудке оцень незначительные, а в остальных органах меченные иодом антитела сравнимы. Для иммунореактивности (см,табл,1) в случае меченного технециемш антитела ВИ 494/32 измерено более высокое значение, чем в случае мечения иодом или индием П р и м е р 3, 50 мг также направ" ленйого против СЕА моноклонального антитела ВЧ 431/2 б частично восстанавливают путем обработки 2-меркаптоэтанолом, очищают и лиофилизируют в дозах по 2,мг в присутствии фосфатного буФера (РН 7,2).Иечение Тс осуществляют с помощью используемой обычно для сцинтиграфии печени метящей единицы, состоящей иэ 13,5 мг тетранатриевой соли 1,1,3,3-пропантетрафосфоновой кислоты. и 0,6 мг хлорида оловак 2 Н О.Содержимое метящей единицы Раст-. воряют в0 мл изотонического раст" вора ИаС 1 и 0,5 мл (15 мкг Бп) добавляют к лиофилизированному антителу. Затем Раствор пертехнетата (3000 МВ ) добавляют к прозрачному раствору антитело -. соло оловаи меченное технециемв антитело вводят внутривенно безволосым мышам с имплантированной человеческой карциномой толстой кивки. Сцинтиграфически опухоль определяют спустя 21 ч после инъекции. В табл,3 приведены данные о накоплении,в опухоли и распределении по органам 1-131, 1 пи Тсш - шаЬ 43/26 в безволосых мышах (п=2) с человеческой карциномой толстой кишки в зависимости от времени.1П р и м е р М 20 мг Г(аЬ) -фрагмента моноклонального антитела171 б 57 Таблица 1 Ионоклональныеантитела Иммунореактивность,Ъ, антител, меченных изо- топами 1-131 1 пТсш ВМ 431/31 85 75 90 ВИ 431/2 б 85 ВУ 494/32 65 95 70 431/3 инкубируют при 4 фС в течение 15 мин с 1 мл 1 Ф-ного раствора цистеамингидрохлорида, Освобожденный от избыточного восстановителя фрагмент антитела лиофилизируют вместе с фосфатным буфером. Для мечения технецием используют метящую единицу, состоящую из 13,0 мг тетранатриевой соли 3 З-дифосфоно,2-пропандикар боновой. кислоты, 0,23 мг оксида олова-П и 1,0;мг мононатриевой соли М-(4-аминобензоил)-1,-глутаминовой кислоты, из которой 1/20 применяют в 0,5 мл физиологического раствора . 15 хлорида натрия. Меченный с удельной активностью 1000 ИВ ц/мг Фрагмент антитела не содержит практически никакого партехнетата, однако содержит примерно Зь Тсш-дифосфоната. Им мунореактивность б 0.П р и м е р 5Тсш-мецение протеина.250 мг 180 концентрации 10 мг/мл растворяют в изотоницеском растворе хлорида натрия. Этот раствор после добавки 0,5-1 мл 2"меркаптоэтанола инкубируют примерно 30 мин при 4- 25 С, Затем восстановленный иммуноглобулин очищают путем .гель-Фильтра ции через колонку с гелем полиакриламида (биогель Рфирмы БИО РАД), причем элюируют с помощью 0,02 И раствора динатрийгидрофосфата (рН 7,2 В отделенной чистой Фракции 18 С пу" тем разбавления .таким же Фосфатным буфером устанавливают концентрацию 4 мг 1 амл (примерно 3 мг МаНРО 4/мл) дозируют, по 0,5 мл этого раствора и лиофилизируют еДля мечения технециемш пробы (2 мг 1 р 6) лиофилизат растворяют,в 1 мл раствора метандифосфоната олоЪ ва(рН 7), который получается пу" тем растворения метящей единицы, состоящей из 2,6 мг натриевой соли метандифосФоновой кислоты и 0,04 мг хлорида оловав 5 млизотоницеского раствора хлорида натрия. Затем добавляют 4-9 мл раствора Тсшпертехнетата (примерно 1000 МВо). После 5 мин реакции получают меченный технециемш 18 С, в .котором имеется более 953 связанного с про" теином технеция, менее 1 Ф связанной с Фосфонатом части и менее 1 ь свободного пертехнетата. Меченный 10 стабилен вплоть до 3 ц после приготовления, Лишь при более длительном времени хранения в растворе обнаруживается снова свободный пертехнетат.Использование предлагаемого способа позволяет повысить прочность ме" чения 9 Тс моноклональных антител или их Р(аЬ ) -фрагментов. Формула изобретения Способ получения меченных пТс моноклональных антител путем смешения ффТс пертехнетата и раствора предварительно обработанного моноклонального антитела или его Р(аЬ ) -Фрагмента в присутствии солей олова, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения качества введения метки, используют соль олова, выбранную из группы: соль оловаметандифосФоновой кислоты, 3-3-дифосфонопропи" оновой кислоты, 3-3-дифосфоно"1,2-прЬ пандикарбоновой кислоты, пропан,1- 3,3-тетрафосфоновой или пирофосфорной кислота в количестве, в расчете на олово, 5-10.мкг соли на 1 мг белка антитела.11711657 8. Таблица 2 Распределение по органам, /г ткани Орган Тсш 1-131 рМышцыЖелудок (Ф вцелом) 0 38 2,50 11 итовиднаяжелезаКишечник 4,85 4,62 49,3 0,05 3,83 24,5 МочаКровь, /мл 14,6 .13,0 20,5 9,2 Кости, Ж в це- лом 1,8 1,7 4,7 4;32,4 2,1 Печень Легкие Селезенка Почки Кости К овь 0,49 0,82 0,65 4,25 0,57 1,97 0,12 0,23 0,48 0,30 0,70 0,20 0,92 0,08