Способ отбора мутантов sтrертомyсеs sрнеrоidеs продуцентов экзопротеазы с фибринолитической активностью

(51)5 С 12 И 15/01, 9/50 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯДТРСИО, :ИДЕТЕЛТ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ(56) Авторское свидетельство СССР В 973609, кл. С 12 П 13/ 10, 1982,Прянишникова Н,И. Мутанты Б.ярйегоЫея штамм У 35 - активного продуцента протеиназ с фибринолитическим действием. - Микробиология и научнотехнический прогресс. - Киев: 1983, с. 125. Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам получения продуцентов биологически активных веществ, может быть использовано в микробиологической и медицинской промышленности, а также в селекции и биохимии.Цель изобретения - упрощение отбора и повышение выхода фермента.Штамм Бггергошусея яр 11 егоЫея В 35 культивируют после обработки ультрафиолетовыми .лучами на средах с высокими концентрациями собственного протеолитического экзофермента, предварительно выделенного из культуральной жидкости продуцента.Способ быстрого получения мутантов-сверхсинтетиков экзопротеаз основан на явлении подавлейия роста, спор исходного штамма собственным экзо.ферментом, Выделение мутантов, выра 2(54) СПОСОБ ОТБОРА МУТАНТОВ БТКЕР Т 01 йСЕБ БРНЕКОТПЕБ - ПРОЛУПЕНТОВ ЭКЗОПРОТЕАЗ 14 С ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОИ АКТИВЦОСТЫ)(57) Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам получения продуцентов биологически активных веществ, Цель изобретения - упрощение отбора и повышение выхода ферментов. Способ заключается в том, что споры Бггергощусея ярйего 1 оея штамм Р 35 обрабатывают ультрафиолетовым светом и высевают на агаризованную среду, содержащую экзопротеазы Б,ярйегоЫея с Фибринолитической активностью в концентрации 5-15 мг/мл.Ф 1стающих в условиях присутствия в среде высоких концентраций собственного фермента, добавленного в среду извне, т.е, в условиях полного подавления роста исходного штамма, позволяет из малого числа отобранных коло" ний получать продуценты с очень высокой протеолитической активностью фибринолитических протеаз.П р и м е р 1. Культуру штамма Бг.ярйегоЫея У 35 выращивают в синтетических средах в аэробных условиях при 28 С на круговой качалке с 200- 220 об/мин в колбах на 750 мл с объемом среды 100 мл. Из культуральной жидкости высаливанием сернокислым аммонием при 90% от полного насыщения после выдерживания в течение 24 ч при +3 С центрифугированием при 10 тыа. об/мин выделяют протеолитический ферментный комплекс, которыйгомогенизируют в минимальном объеме буфера трис-НС 1, рН 7,5, и подвергают диализу в течение 24 ч против этого же буфера, Полученный ферментный раствор (концентрации 10 мг/мл по белку), вносят в стерильные металлические из нержавеющей стали объемом 1 см цилиндры, стоящие на поверхности твердой среды для выращивания стрептомицетов, уже густо засеянные моноспоровой суспензией спор, содержащей 2 10 -2.10 спор стрептомицета7 8в 1 мл фосфатного буфера 0,005 М, рН 7, подвергшейся предварительно облучению УФ-лучами в оптимальной для получения "+" вариантов дозе. Через 5 дней инкубации просматривают засеянные чашки Петри (среду в чашках Петри приготавливают с агаром в концентрации 1 Х, что обеспечивает лучшую диффузию Фрагмента в агар, а посев густым газоном исключает стадию подбора концентраций высеваемых на чашки Петри суспензий, необходимую 25 при рассеве на фибриновые среды что значительно упрощает селекционную работу)Зона подавления роста стрептомицета при этом составляет 30-40 мм ,вокруг цилиндров с Ферментом, и толь-, ко единичные колонии все же вырастают в этом пространстве. Зти колонии ,отбирают и пуоверяют их способность к образованию экзопротеаз с фибринолитическим действием. Мутанты выращивают на синтетических средах со стадией предварительного инокулирования.П р и м е р 2, Культуру штамма БСг,зрйегоЫез Р 35 выращивают на синтетических средах в аэробных условиях при 28 С на круговой качалке с 220-200 об/мин в колбах на 750 мл с объемом среды 100 мл. Из культуральной жидкости высаливанием45 сернокислым аммонием при 907 от пол-. ного насыщения, после выдерживания в течение 24 ч при +3 С центриФугированием при 10 тыс.об/мин, выделяют протеолитический Ферментный комплекс, который гомогенизируют в минимальном объеме буфера трис-НС 1, рН 7,5, и подвергают диализу в течение 24 ч, против этого же буфера. Полученный ферментный раствор в кон-центрации 15 мг/кг по белку вносят 55 в стерильные цилиндры из нержавеющейстали, стоящие на поверхности твердой среды. Далее операции аналогичны примеру 1. Зона подавления ростастрептомицета при этом составляет 30- .40 мин вокруг цилиндров,Единичные колонии, выросшие в этойзоне, отбирают и проверяют их фибринолитическую активность.П р и м е р 3. Культуру штаммаБгг.зрйегоЫез Р 35 выращивают насинтетических средах в аэробных условиях при 28 С на круговой качалкес 200-220 об/мин в колбах на 750 млс объемом среды 100 мл; Из культуральной жидкости методом, аналогичнымпримеру 1 и 2, выделяют протеолитический ферментный комплекс. Полученный Ферментный раствор вносят в стерильные металлические цилиндры изнержавеющей стали в концентрации5 мг/мл по белку. Дальнейшие операции с опорами стрептомицета аналогичны примеру 1 и 2. Диаметр зоны подав,ления роста культуры на чашках Петрисоставляет 15-20 мм вокруг цилиндровс Ферментом. Так как зона мала, товыросшие колонии из нее практическиотобрать невозможно.Таким образом, оптимальная концентрация вносимого ферментного раст-,вора составляет 10 мг/мл, увеличениеконцентрации ферментного растворадо.15 мг/мл, связанное с большимрасходом Фермента, не дает увеличения зоны подавления роста, уменьшение же концентрации до 5 мг/мл ведетк значительному уменьшению величиныдиаметра зоны подавления роста, чтоделает отбор невозможным.Формула изобретенияСпособ отбора мутантов Бгерошусез зрЬегоЫез - продуцентов экзог.ротеазы с фибринолитической активностью, предусматривающий обработку штамма Б.зрЬегоЫез Р 35 ультрафиолетовым светом с последующим высевом спор на селективную среду, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения отбора и повышения выхода фермента, споры высевают на среду, содержащую экзопротеазу из Б,зрйегоЫев в концентрации 5-15 мг/мл.