Штамм вкм-а591-продуцент холестериноксидазы

Союз Советскнк Соцналнстнческня РеспублнкОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ УВПТБ 1)М. Кл. Дополнительное к авт. с) 25 9 г нем заявки И 12 О 13 1 с присоед Гос арственны 1 СССР елвм изобре и открыти.С. Назарова,(71) Заявите Инст обиологии АН СС) ШТАММ АП 1 ЙОМУСРЮ ЕАЧГМПОАЕ ВКМ-А 591 -ПРОДУЦЕНТ ХОЛЕСТЕРИНОКСИДАЗЫ он+И Оативколитеринагоичесльнокрови 25 Изобретение относится к областимикробиологйческого синтеза Ферментов и касается получения штаммав,продуцирующих холестериноксидазу.,Холестериноксидаза, каталиэирующаяпревращение холестерина согласноуравнению:холестерин+Оя- а 4-холестенможет быть применена в препарной медицинской биохимии длячественного определения халесв крови. Применение Ферментнопрепарата в лаборатЬрных клинких анализах позволит значитеускорить проведение анализовна холестерин.Известно, что многие микроорганизмы способны использовать холестерин в качестве единственного источника углерода. В ряде случаев былопоказано превращение холестерина вхолестенон с помощью ферментных прпаратов, полученных из различныхмикроорганизмов.В настоящее время для полученияхолестериноксидаэы используютсяпреимущественно микроорганизмы рода ИосагЫа которые выращиваются на средах, содержащих холетерин,Наиболее близким по своей техЪичес кай сущности к изобретению является штамм-продуцент халестеринаксидаэы, относяшийся к виду Ргаостюо 1 осе.егУтЬ-араб з 11Холестериноксидаэа является внутриклеточным Ферментам, поэтому для ее получения клетки микроорганизма-продуцента должны быть разрушены, Клетки нокардий и проактинамицетов трудно разрушаются, так как их клеточные стенки содержат большее количество васкав и липидав па сравненйю с другими микроорганизмами.Целью изобретения является штамм актиномицетов Ас 6 патчсе., ЧочепсЬРое ВКМ-А 591, образующий внутриклеточную холестериноксидазу. При выращивании Ас 1 юогосе ь 1 очегкми 9 де на простой среде в течение 20 - 22 ч образуется до 2 г/л сухой биомассы с удельной активностью 1,5 ед/г. Мицелий Асбпоггсе 1 счетсаРое разрушается значительна легче, чем клетки нокардий и праактинамицетов, Кроме того, Ас 11 погпчсеь 1 очепдо 1 ае обладает антибиотической активностью, что предотвращает.заражение культуры при выращивании в больших объемах.Биомассу, дважды промытую соляиокислым трис-буфером рН 7,9 с добавлением ЭДТА (500 мг на 100 мл), раэ рушают в замороженном виде под давлением 4000 кг/см. Фермент экстрагируют тем же буфером в течение 24 чпри 5 С и разрушенные клетки удаляютцентрифугированием при 20000 д втечение 30 мин, Иэ полученногоцентрифугата ферментный препарат получают высаливанием сульфатом аммония при насыщении 0,7. Выход холестериноксидаэы составляет 1,5 Е 50на 1 г сухой биомассы (удельнаяактивность препарата 0,04 Е/мг белка).При этом одна единица активности(1 Е) соответствует образованию1 мкмоля холестенона в 1 мин при37 С в следующей реакционной смеси;2,80 мл 0,5 М фосфатного буфера,рН 7,0; 0,15 мл раствора холестеринав зтаноле (с : 3,86 мкг/мл), 0,03 мл2-твин(с : 0,5), 0,02 мл экстрактамицелия актиномицета.О Сопоставление предлагаемого штамма с продуцентом холестериноксидазыРгосс 1 юатчсеь е.Ьорц"1 ъ приведено в таблице. Предлагаемый штамм был выделен иэокультуренной почвы Подмосковья,,селекционирован и идентифицированкак Асбйотсеь аепсо 9 оеВКМ-А 591. Штамм хранится во Всесоюзной коллекции непатогенных микро 5организмов ИНМИ АН СССР,Морфология. Типичный актиномицет,. имеющий разветвленный мицелий,около1 мкм в поперечнике, Спороносцы спримитивными спиралями около 0,5 витка, расположены одиночно. Споры овальные с гладкой оболочкой.:Культуральные признаки. На агаризованной глюкозоаспаргиновой среде,применяемой для получения активнойбиомассы,при посеве на чашки Петри 15,образуют круглые выпуклые колониис приподнятым центром,Окраска воздуш-ного мицелия в центре колоний сероватороэовая (цвет лаванды),по перифериисерая, Субстратный мицелий темнобурого цвета. На картофельном агаре образуются выпуклые колонии до100 мм в диаметре с воздушным мицелием светло-серого или белого цвета.Субстратный мицелий светло-бурый.Вокруг колоний на картофельном агаре часто образуются бурые зоны извыделяемых в среду меланоидных пигментов. На ломтиках картофеля колонии складчатые, воздушный мицелийЗОскудный, серого цвета, КартофельбуреетНа масло-пептонном бульонеобразует на поверхности пристеночноекольцо, затем хлопья, выпадающие восадок.35Хорошо растет на глюкозо-дрожжевойсреде, образуя колонии до 10 мм в диаметре белого или сероватого цвета;воздушный мицелий хорошо развит на5 сут. по всей поверхности колоний,образуется бурый пигмент, выделяемый в среду,На среде СРКрасильникова растет очень хорошо, колонии крупные "(до 13 мм в диаметре на 8-10 сут),воздушный мицелий серого или серовато-коричневого цвета хорошо развитпо всей поверхности колоний, нижняясторона колоний темно-бурого цвета.На среде Чапека с глюкозой растетплохо, образует мелкие (до 5-7 мм вдиаметре) полупрозрачные колонии,воздушный мицелий слабо развит, локализован по краям колоний, пигмент необразуется.На сусло-агаре с 0,5% мела растетмедленноколонии мелкие (до 5 мм),слабо развитый воздушный мицелийпоявляется на 7 сут, пигмент не образуется,Физиологические признаки,Желатинуне разжижает, Молоко подщелачивает и пептонизирует без коагуляции на 10-12 сутпри 28 С. Серооводород и индол не образует. Нитраты не востанавливает. В качестве источника углерода потребляет глюкозу, галактозу, мальтозу, глицерин, маннит, лимонную кислоту, хуже растет на манноэе, фруктозе, рамноэе, янтарной и пировиноградной кислотах, Не потребляет ксилозу, инулин, сорбит, инозит, дульцит, зскулин, щавелевую и уксусную кислоты.Оптимальная температура роста 28 - ЗООС. При 20 С рост удовлетворительный, воздушный мицелий слабовит. При 37 оС рост очен слабый без воздушного мицелия. при 50 С роста нет. Антимикробный спектр. Предлагаемый штамм Лсбоогпмсеь Рсхчепсюоос подавляет рост грам-положительных бактерий и слабо активен против грамотрицательных бактерий.П р и м е р. Получение холестериноксидазы иэ мицелия Лс 11 оп 1 чсе, 1 оуеосоос ВКМ-А 591Посевным материалом служит жидкая односуточная культура Лс(1 оогочсе; Ьъчепсоое ВКМ-А 591, выращенная на среде следующего состава,Ъ: глюкоза 0,5, аспарагин 0,05, дрожжевой экстракт 0,1, рН 7,0-7,2, Выращива-, ние биомассы проводят ферментерах объемом 100 л на вышеуказанной среде, Количество посевного материала составляет 7,0 от .объема среды, Длительность выращивания 22 ч. При таком культивировании получают 2,0 г сухой биомассы иэ 1 л жидкой культуры.,01 Ас 6 оогпусезГаме осло Ва е, 04-0, 0 о Формула изобретен зе аз 2007/3 ЦНИ Проектна лиал ППП тПатент жгород Как видно из таблицы, предлагаемый штамм ЬсЛлпопчсе 0 аченсо 0 ае отличается от Ргоас 1 аогпусе егуЮгорот 1 ь более высокой удельной активностью в расчете на белок (в 4-6 раз) при одинаковом выходе биомассы. Кроме того, в отличие от ргоас 0 погпусеь ,егуЬгоробз, который выращивается на сложной среде, содержащей большое количество компонентов, для выращивания биомассы 4 сОп огоусеРачеоботае применяется простая среда. Клеточные стенки 4 соогтгсе ачегпЗо 1 ое легче разрушаются йо сравнению с проактиномицетами, и большое количество биомассы 4 сбоогпусе рачепаоЕае может быть легко обработано для получения и накопления Фермента. Антибиотическая активность Ас.итогпусе Рачепс 3 аЦае предотвращает развитие инфекции в культуре, что особенно важно при выращивании в больших объемах. Штамм Ас 1 юпогтусеэ Рачепсюа Рае ВКМ-А 591 - продуцент холестеринокЬидаэы. Хранится во Всесоюзной коллекции непатогенных микроорганиэМов ИНМИ АН СССР,Морфологические признаки, Актиномицет, имеющий разветвленный мицелий около 1 мкм в поперечнике. Спороносцы с примитивными спиралями около 0,5 витка, одиночные Споры овальные с гладкой оболочкой. физиологические признаки, Рост на ор ганической среде, На картофельном угаре рост хороший, колонии круглые, выпуклые, белого или сероватого цвета. В пробирках со скошенным картофельным агаром при посеве штрихом окраска воздушного мицелия серая с розрвым оттенком (цвет лаванды). Наломтиках картофеля воздушный мицелий скудный серого цвета. Ломтики2 О картофеля приобретают бурую окраску.На мясо-пептонном бульоне рост ввиде пристеночного кольца на поверхности, затем образуются хлопья, оседающие на дно; с образованием осадка,Рост на синтетической среде. Наагаризованной систетической средеЧапека с глюкозой рост слабый. Колонии до 5 мм в диаметре, воздуш-.ный мицелий слабо развит, появляетсяна 7-8 сут.,локализован йо краям колоний, пигмент не образуется.Молоко подщелачивает, пептониэируетбез коагуляции на 10-12 сут. при 28 С.Желатину в течение 14 сут, при10 С не разжижает,З 5 Индол не образует, Сероводор дане образует,Нитраты не восстанавливает.Отношение к источникам углерода.Усваивает глюкозу,галактозу,мальтозу, .глицерин,маннит,лимонно-кислый калий.Слабый рост на маннозе,фруктозе,рамноэе,янтарнокислом натрии,пировинограднокислом натрии.Не ассимилируетксилозу, арабиноэу, сахарозу, лак 45тоэу, раффиноэу, крахмал, инулин, целлюлозу, сорбит, инозит, дульцит,эскулин, щавелевокислый натрий, Уксуснокислый аммоний,Антимикробный спектр.,Подавляетрост грам-положительных бактерий ислабо активен против грам-отрицательных бактерий.Ферментативные свойства. Являетсяактивным тродуцентом холестеринокси- .дазы,55 Источники информации,принятые вовнимание при экспер 1, Патент ФРГ Р 2224133,кл. С 12 Э 13/10, 1973.