Способ выделения калликреинтрипсин-ингибитора

1 Ц 44 УО СОюз СОЗО 1 ски СОпизпистичес;их Веспубпик(5) Ь С 07 д 7 авета Министров СССР Ьюччетепь о 3Опуб1Лата ковано 30.08.74 3) УДК 547,964.4зоЛрвтгвий Открытии опубликования описания 13.06. 72) Автор изобретен И по. тр а нецристиан Гельбмепн собом нообменнуют 1 н. ИаОН, 30(32) Приоритет 24.04.7 сударствгнкый кои;тгт , 133) ФРГ Изобретение от,лсится к улучшению способа выделения каллпкреинтрипсин-ингибитора.Известен способ выделения калликрспнтрпгснн-ингибитора путем его присоединения и полимеру, предварительно связанному с трппсином. При этом удаление связанного каллпкреинтрипсин-ингибитора и его обсссоливание производят известными способами.Сложность этого метода заключается в необходимости предварительного связывания по о лимера с трипсином.Согласно предлагаемому изооретепию способ выделения калликреинтрипсин-ипгибитора из неочищенных растворов заключается в том, что неочищенный раствор калликреинтрипсин ингибитора пропускают сквозь колонку, заполненную амфотерным ионообменникоз 1 на основе полистирола, который обычно содержит аминоуксусные и(или) иминодиуксусные группы. При этом калликреинтрипсин-ингиби тор адсорбируется на ионообменнике, а неадсорбированное вещество вымывают буферным или солевым раствором. Последующее элюирование калликреинтрипсин-ипгибитора обычно осуществляют при концентрации хлори стого натрия 025 моль и при рН 6 - 10, преимущественно 6,2 - 8. Обессоливание производят известными способами.П р и м е р 1. Амфотерную иосмолу последовательно промываю дистиллированной водой, 0,5 н. НС 1 и дистиллированной водой, 0,01 М Ха/К-фосфатным буфером со значением рН 8,0. 100 мл предвариге.,ьно обработанной таким образом ионнообменной смолы вводят в колонку (2,5 к,20 см), Калликреинтрипспп-ингибитор, адсорбированный на кизельгуре, со степенью чистоты примерно 2000 едшшц калликреинтрипсин-ингибитора на 1 мг экстрагпруют водой. В этом растгорс путем попеременного добавления ионоооменииков (форма Н 4 и ОН в ) устанавливают удельнуютеплопроводность 0,12 м Ьсм в . 670 мл этого раствора с 5100 единицами каллпкрепнтрппсин-ингибитора/мл (общая активность 3,4 К 10 единиц калликрешггрипсин-ингпбптора) вводят в ко.чонку, заполненную ионообменной смолой, со скоростью 1,15 мл,мин/см-. Колонку промываю г 0,01 М фосфатым буфером и активное вещество элюпруют с помощью 2 л 0,01 М фосфатного буфера со значением рН 8,0 и 1,0 М ХаС 1 со скоростью 0,35 мл/мин/см путем создания линеппого солевого градиента. Активные фракции объединяют, обессоливают ионообменником и раствор подвергают лиофильной сушке. Выход составляет 87%, удельная активность 6030 ед калликреинтрипсин-ингибитора/мг,П р и м е р 2, Амфотерный ионоо ик готовят оппса: иым в примере 1 спо и441710 15 Предмет изобретения Составитель Я, Соколов Техред Н. Куклина Корректор Л. Орлова Редактор Л, Герасимова Заказ 1348/7 Изд. Мз 1284 Тираж 506 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж-З 5, Раушская наб., д. 4,5Типография, пр, Сапунова, 2 уравновешивают 0,01 М Ха/К-фосфатным буфером со значением рН 6,2 и 0,001 М этилепдиаминтетрауксусной кислотой (ЕДТА) . 100 мл ионообменной смолы вводят в колонну (2,5 К 20 см). 20 мл предварительно очищенного раствора ингибитора активностью 10000 единиц калликреин-ингибитора/мл (общая активность 2,2 К 10, единиц калликреин-ингибптора) и частотой 4000 единиц калликреин-ингибитора/мг вводят в колонну со скоростью 0,35 мл/мин/см, Колонку промывают 0,01 М фосфатным буфером и затем активное вещество элюируют с помощью 2 л 0,01 М фосфа гного буфера со значением рН 6,2 и 0,01 М этилендиаминтетрауксусной кислоты и 2 л 0,01 М фосфатного буфера со значением рН 6,2, 0,001 М этилендиаминтетрауксусной кислоты и 1,0 М ИаС путем создания линейного солевого градиента.Активные фракции объединяют, обессоливают ионообменниками и раствор лиофплизуют. Выход составляет 86/ удельная активность 5000 единиц калликреин-ингибитора/мг. Иммуноэлектроферрограмма показывает одну полосу наряду с сопутствующим антигеном, в то время как исходный продукт показывает большое количество полос.П р и м е р 3. Амфотерную иопообмспную смолу готовят аналогично примеру 1 и уравновешивают 0,01 М 1 а-К-фосфатным буфером со значением рН 8,0 1300 мл сырого, но еще сильноокрашенпого раствора ингпбитора с удельной активностью 7800 ед. калликреипингибитора/мл (общая активность 10,1 Х О" единиц калликреин-ингибитора) со степенью чистоты 2400 единиц калликреппнппч 1 бптора мг с 100 мл понообменнпка вводят со скоростью 0,35 мл/мин/см в колонну (2,5 Р, К 20 см), 11 осле промывки 0,01 М фосфатпым буфером активное вещество вымывают, созда вая линейный градиент ХаС в фосфатном буфере. Активные фракции объединяют, обессоливают ионообменникамп и раствор лиофилизируют, 11 олучают 1,58 г твердого вещества с удельной активностью 5500 единиц калликре ин-ингибиторамг (общая активность 8,68)(10"единиц калликреин-ингибитора), что соответ.ствует 86%. Полученный продукт оесцветен и совершенно свободен от побочных антигенов. 1. Способ выделения калликреинтрипсипингибитора из его неочищенных растворов,о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упроще 20 ния способа, сырые растворы каллпкрепнтрипсин-ингибитора адсорбируют на амфотернойионообменнои смоле на основе полистирола споследующим удалением неадсорбированныхвеществ путем промывки буферным раствором25 или солевым раствором, вымыванием калликреинтрипсин-ингибатора с помощью создания солевого градиента и выделением целевого продукта известными приемами.2, Способ по и. 1, отличающийся тем,что вымывание путем создания солевого градиента проводят при значении рН 6,0 - 10,0.3. Способ по п. 1, отл ич а ющп йс я тем,что применяют ионообменные смолы на основеполистирола, содержащие радикалы ампноук 85 сусной кислоты, или радикалы иминодпуксуспой кислоты, или их смесь,