Способ получения тромбиноподобных ферментов

Союз Советских Социалистических РеспубликОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК ПАТЕНТУ п 946389(53) УДК 615,45.; :615.94 (088,8) Опубликовано 230782. Бюллетень27 ао делам нзобретеннй и открытийДата опубликования описания 25. 07. 82,(72) Автор изобретения ИностранецКурт Ф. Штоккер (Швейцария) Иностранная Фирма(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРОМБИНОПОДОБНЫХФЕРМЕНТОВ Изобретение относится к химико- фармацевтической промышленности и касается получения тромбиноподобных ферментов, которые находят применение в качестве реактивов для изучения процессов .свертывания крови, в качестве противогеморрагических лекарств и в качестве средств для экспериментального и терапевтического дефибриногенирования. ОИзвестен способ получения тромбиноподобных ферментов путем хроматографии змеиного яда 1 ,Однако известный способ является трудоемким и неэкономичным, так 16 как позволяет хроматографировать лишь небольшие количества сырого яда на относительно больших колоннах.Цель изобретения - упрощение способа. 20Эта цель достигается тем, что согласно способу получения тромбиноподобных ферментов путем хроматографии змеиного яда, змеиный яд в водном растворе или в буфере рН 4- 10 2 Ь с содержанием 0,01-0,5 моль на литрхлористого натрия обрабатывают гепарином, иммобилизированным через аминогруппы на инертном носителе, и выделяют целевой продукт. В качестве исходного вещества для осуществления способа пригодны водные растворы, центрифугированные или отфильтрованные до прозрачности сырого змеиного яда змей семейства бго 1 бае, в частности видов Ау 11 зйгобоп, ВойЬгорз, СгоСаЬз, Тг 1 щегезц гцз, можно использовать и фракции змеиных ядов, центрифугированные или отфильтрованные до прозрачности, содержащие тромбиноподобные ферменты в обогащенном виде, и из которых балластные вещества удалены осаждением кислотой или термической обработкой, могут быть также использованы сырые препараты тромбиноподобных ферментов змеиных ядов, полученных осаждением Фенола или его производным из сырого яда.20 з 9 ч 638Нерастворимый гепарин можно получить взаимодействием гепарина известным способом через его аминогруппыс реакционноспособными группами полимерного нерастворимого в воде5вещества - носителя, связывая его,тем самым, ковалентно с носителем.Нерастворимый гепарин можно, например, получить предлагаемым способом путем связывания гепарина1 Ос агарозой по цианогенбромидномуметоду, путем связывания с путресцинагарозой.,по тифосгеновому методуили путем связывания с эпсилонаминокапроилагарозой по карбоди 15имидному методуВ качестве носителя можно приме.нять и целлюлозу и ее соответствующие производные, т.е, путресциновуюи эпсилонаминокапроилцеллюлозу, Нерастворимый гепарин целесообразнополучать и путем взаимодействия гепарина с поперечно сшитой цианогенбромидной агарозой в виде шариковили бусин стандартной величины,Обработку исходного материала нерастворимым гепарином (т.е. связывание тромбиноподобного фермента змеиного яда с гепарином) и отщеплениефермента из нерастворимого гепаринаможно вести по порциям путем размешивания исходного материала, растворенного в воде, водном буферном растворе, водном растворе электролита безбуферного действия или, в крайнемслучае, с небольшим буферным действи- з 5ем или же содержащем как буфер, так инейтральную соль, например хлористыйнатрий, вместе с родственным адсорбентом (т.е. нерастворимым гепарином) с последующей фильтрацией, илиже, предпочтительно, хроматографиейпо химическому родству на колонне.В качестве электролитов пригоднынеорганические и органические соли,например хлористый натрий, хлористыйаммоний, сульфат магния, сульфат аммония, ацетат натрия, хлористый кальций, бикарбонат аммония, формиат аммония, триэтиламингидрохлорид; илиже органические кислоты, как например уксусная, винная или лимонная;или же основания, как например гидроокись аммония, триметиламин, триэтиламин, При хроматографии по химическому родству нерастворимый гепарин заливают в колонну, диаметр которой соо 1 ветствует примерно однойдесятой ее высо 1 ы, и эквилибрируют 9 фтой же водной средой, в которой растворен исходный материал, На выходеиз колонны целесообразно установитьфотометрицеский расходомер, измеряючщии и автоматически записывающийоптическую плотность выходящих элюатов при надлежащем диапазоне волн(280 или 251 нм). Элюаты, предпочтительно, разбивают на фракции посредством автоматического коллекторафракций и собирают,хроматографию по химическому родству ведут следующим образом, Исходный материал (сырой змеиный яд илиего фракцию) растворяют в воде, водном буферном растворе или водномрастворе электролита, например растворе хлористого натрия, или же водном растворе, содержащем как буфертак и нейтральную соль, например хлористый натрий. Раствор фильтруют допрозрацности или центрифугируют изатем заливают в колонну, Колонну дотех пор промывают той же водной средой, что и та, в которой растворен исходный материал, до тех пор,пока в выходящем элюате больше нельзя обнаружить поглощающие Уф-лучивещества. Затем колонну промываютводным алюентом, например буфернымраствором или электролитным раствором или раствором, содержащим какбуфер так и нейтральную соль, например хлористый натрий, концентрация которого превышает таковую водной среды, в которой растворен исходный материал, с целью отщеплениятромбиноподобного фермента змеиногояда от нерастворимого гепарина, Промывают до тех пор, пока не элюируется поглощающее Уф-лучи вещество. Затем промывают еще раз буферным раствором, раствором электролита илираствором, содержащим как буфер,так и нейтральную соль, напримерхлористый натрий, отличающимся концентрацией, достаточной для удаления без остатка из колонны веществ,более сильно связанных с нерастворимым гепарином, чем тромбиноподобные ферменты, так что после осаждения адсорбент по родству снова можнорегенерировать и использовать для нового процесса.В качестве буФерных растворовпригодны водные растворы солей неорганических или органических оснований с неорганическими или органическими кислотами или же соли амфо5 9терных веществ, развивающих буферноедействие в пределах рН 4-10. В частности, пригодны нетоксичные вещества или их смеси, не содержащие ароматических групп и поэтому не поглощающие свет дпиной волн 280 или254 нм и которые тем самым, не мешают проведению Уф-фотометрическогоконтроля процесса хроматографии, вчастности буферы на основе глицина/гидроокиси натрия, уксусной кислоты;гидроокиси натрия, лимонной кислоты/гидроокиси натрия, триэтаноламинасоляной .кислоты, лизина./ соляной кислоты, глицилглицина/соляной кислоты,фосфата натрия, а также летучие ввакууме буферные системы как буферына основе формиата аммония, ацетата аммония, этилендиаминтетраацетата.Для применения в прерывистом способе далее пригодны буферы на основе гидрокарбоната натрия, гидрокарбоната аммония, однако они для хроматографических операций непригодныиз-за выделения СО. Тромбиноподобные ферменты из различных змеиныхядов обладают разным родством к нерастворимому гепарину, связанному нерастворимым наполнителем. В соответствии с этим состав буферов биологического происхождения следуетсогласовывать с выделяемыми ферментами,Чем меньше концентрация буферного или электролитного раствора или раствора буфер-нейтральная соль, тем лучше фермент связывается с нерастворимым гепарином,Однако при низкой концентрации максимальной является неспецифическая способность гепарина связывать белки, концентрации надо подбирать такими, при которых связывается тромбиноподобный Фермент, остальные же белки проходят через колонну без задержки. Для каждого отдельного яда оптимальные условия по концентрации могут быть определены простыми предварительными экспериментами.Связывание всех исследованных тромбиноподобных ферментов из змеиных ядов происходит при концентрациях буферных растворов или электролитных растворов или растворов буфер-нейтральная соль в пределах диапазона молярности 0,01-0,5 и рН 4- 10 в зависимости от рода яда.Ф 5 0 15 20 25 ЗО 35 40 45 50 55 9 6Для отщепления тромбиноподобных Ферментов из змеиных ядов, связанных с нерастворимым гепарином, применяют буферные растворы или электролитные растворы или растворы буфер- нейтральная соль, обладающие более высокой концентрацией, чем раствор, используемый для связывания Фермента к нерастворимому гепарину, Предпочтительно применяют тот же раст-: вор буфера, что и для связывания фермента к нерастворимому гепарину, однако концентрацию его повышают путем добавления сильно диссоциирующей соли нейтрального характера, предпочтительно хлористого натрия, таким образом, что связанный фермент отщепляется от нерастворимого гепарина.Поскольку в некоторых змеиных ядах содержатся и другие вещества с родством к нерастворимому, гепарину, концентрацию используемого для элюирования раствора, предпочтительно, доводят до значения, при котором тромбиноподобный Фермент отщепляется, другие же вещества с более сильным родством остаются связанными с нерастворимым гепарином.Отщепление всех связанных с нерастворимым гепарином тромбиноподобных ферментов из змеиных ядов проводят предпочтительно при концентрациях диапазона от 0,1-2 молей и при рН диапазона 4-10.Удаление всех связанных с нерастворимым гепарином компонентов ядов с родством к гепарину, превышающим,таковое тромбиноподобных ферментов, целесообразно проводить с применением буферных растворов или растворов электролита или растворов буфер/нейтральная соль, с молярностью 0,5-2 и диапазоном рН 4-10, Предпочтительно концентрацию первого буферного раствора, используемого для связывания фермента, и нерастворимый гепарин, доводят путем добавления нейтральной соли, предпочтитель но хлористого натрия, до желательного значения. Адсорбент переводят в рабочее состояние путем промывки первым буферным раствором, использованным для связывания фермента с нерастворимым гепарином.Родство нерастворимого гепарина к тромбиноподобным ферментам из змеиных ядов при низкой температуре мак.946389 40 симально и снижается с повышениемтемпературы, Это явление можно использовать для инициирования связывания фермента к нерастворимому гепарину при низкой температуре, например в охлаждаемой ледяной водой колонне, равно как и отщег пения фермента повышением температурв охлаждающей или обогревательной рубашке колонны, например до 40 С, с применением 10оодного единственного буферного раствора постоянной концентрации и постоянного значения рН.Отщепление фермента от нерастворимого гепарина осуществляют при постоянной концентрации водной среды набуфере и/или нейтральной соли путемповышения или снижения значения рНвыше или, соответственно, ниже такового, при котором происходит связывание фермента с нерастворимым гепарином, рН для каждого Фермента определяют проведением простых предварительных опытов,Содержание тромбиноподобного фермента из змеиного яда в элюатах, полученных при хроматографии на колонне,определяется опытом по свертыванию,предпочтительно на фибриногене.В качестве опыта по свертываниюпригодно, например, определение времени свертывания в секундах по добавлении,0,2 мл разбавленного элюатак 0,2 мл 0,4-ного фибриногена (крупного рогатого скота) при рН 7,4 и37 С, Простое определение временисвертывания пригодно для полученияграфика профиля активности в видекривых элюирования, По той же технике с применением тромбиновогостандартного препарата или с применением стандартного препарата дляданного тромбиноподобного ферментаиз змеиного яда калибровочной кривойактивности можно получить из време 45ни свертывания в количественных данных,(еди ницы Ма 11 опа 1пз 1йц 1 е отНевой (йН) или единицы Апсгод илиединицы ВасгохоЬ и) .Содержание тромбиноподобного50фермента можно определить и фотометрическим путем с применением синтетического хромогенового тромбинового субстрата, например Тову-РгоАгд-рйА.НС 1 в ферментных единицах.55Одна единица (О) в таком случае обозначат количество фермента, отщепляющее в условиях опыта в течение1 мин и 1 м моль субстрата,8Из собранных активных фракций затем удаляют нежелательные буферные вещества и соли путем диализа полностью или частично, Одновременные обессоливание и концентрацию собранных активных фракций осуществляют ультрафильтрацией, например с применением мембраны 01 аГо-МегпЬгап ОИ.Необходимость обессоливания и концентрации фракции, содержащей тромбиноподобный фермент из змеиного яда, зависит от рода применяемого буфера, обработанного хроматографией количества вещества и назначения продукта, При использовании нетоксичных буферных систем, как например глицина /йаОН/МаСг ,для получения тромбиноподобных ферментных препаратов для экспериментального и/или терапевтического дефиброгенирования для возможности получения из собранных активных фракций элюата известными способами изотонического стерильного, не содержащего . пирогена раствора, требуется только частичное обессоливание или же его не требуется вовсе, Частичное обессоливание является достаточным и в том случае, когда содержащийся в элюате тромбиноподобный фермент змеиного яда нужно повторно хроматографировать с целью дальнейшей очистки, в таком случае достаточно доведение концентрации буфера или соли элюата до более низкого значения, необходимого для связывания по химическому родству, чтобы фермен оказалось возможным снова связать с нерастворимым гепарином.П р и м е р 1. 9 г гепарин-натрия специфической биологической активности 162 международных единиц на мг растворяют в 1 л 0,1-молярного натрийбикарбонатного буфера, содержащего 0,5 моля/л хлористого натрия и рН которого равняется 8,3. В раствор добавляют 45 г СМВг-сефарозы 4 В, которой перед тем дают набухнуть и очиститься в 0,001 н соляной кислоте, Смесь 2 ч перемешивают, По окончании реакции смесь фильтруют на стеклянном нутче типа С, отфильтрованный продукт сефароза-гепарин промывают пять раз натрийбикарбонатным буфером указанного состава по 300 мл. Для насыщения еще содержащихся реакционноспособным групп СМВг сефарозу-геггарин 2 ч5 1 О 15 20 25 30 35 40 45 5055 9 94перемешивают вместе с 1 л 0,54-ногоэтаноламина в натрийбикарбонатномбуфере указанного состава. Затемсефарозу-гепарин снова собираютна стеклянном нутце и еще триждыпромывают натрийбикарбонатным буфером по 300 мл, После этого сефарозу-гепарин до тех пор домывают0,1-молярным натрийацетатным буфе-ром рН 4,0, пока рН Фильтрата небудет доведен до 4,0. Наконец, ставший нерастворимым гепарин промываютнесколькими порциями 0,1-молярногоглицина /йаОН-буфера рН 8,5; заполняют в колонну диаметром 26 мм иосаждают тем же самым буфером на основе глицина /гидроокиси натрия,Колонну зат ем и ереналажи вают нанисходящую хроматографию, высотаколонны 29 см, тем самым содержаниенерастворимого гепарина равняетсяпримерно 153 мл. Выход из колонныподклюцают через фотометрическийрасходомер, настроенный на измерениеволн диапазона 280 нм и оснащенныйавтоматическим самописцем, к сборнику фракций, установленному насбор фракций по 350 капель.30 г яда змеи Войгорз айгохрастворяют в 600 мл дистиллированной воды. Значение рН растворадоводят до 3,0 с помощью 1-н хлористого водорода и по истеченииодного цаса инкубационного процесса до 7,3 с помощью 1-н гидроокисинатрия. Полученный при этом продукт в виде хлопьев отделяют центрифугированием и выбрасывают, В остаток, добавляют раствор 15 г натрийсалицилата в 300 мл дистиллированной воды. рН раствора доводят до3,0 с помощью 1-н хлористого водорода, По истечении 60 мин образовавшийся осадок удаляют центрифугированием, растворяют в 200 мл 0,1-молярного буфера на основе глицина,гидроокиси натрия со значением рН8,5 и до тех пор промывают этим буфером на ультрафильтре, пока по добавлении хлористого железа - (11)х-валентного проба фильтрата не будет окрашиваться в фиолетовый цвет,т.е. не будет более содержать салициловой кислоты,Оставшийся на фильтре концентратв количестве около 30 мл обрабатывают 0,1-молярным буфером на основеглицина/гидроокиси натрия со значением рН 8,5 до достижения объема 6389 10 50 мл. Содержание батроксобиновыхединиц (ВО) на мл составляет в таком случае 2240, продукт загружаютв подготовленную колонну из сефарозы- гепарина. Прополаскиванием 750 мл0,1-молярного буфера на основе глицина/гидроокиси натрия со значениемрН 8,5 (буфер 1) элюируют балластные вещества, Затем колонну элюируют0,1-молярным буфером на основе глицина-гидроокиси натрия со значениемрН 8,5 (буфер П), содержащим0,1 моль/л хлористого натрия, до техпор, пока не пройдет 1120 мл жидкости, при этом снова удаляют элюированием балластные вещества. Послеэтого тромбинообразный фермент улавливают в виде двух абсорбирующихУФ-лучи коагулирующих фибриногензон путем элюирования с применением0,1-молярного буфера на основе глицина/гидроокиси натрия со знацением.рН 8 5 (буфер Ш), содержащего0,25 моля/л хлористого натрия, до количества протекающей жидкости900 млн,Наконец, путем элюирования с применением 600 мл буфера на основе глицина/гидроокиси натрия со значением рН 8,5 (буфер 1 Ч), содержащего 1 моль/л хлористого натрия, удаляют вещества, оставшиеся связанными с сефарозой-гепарином,Тромбиноподобный фермент (батрак собин) содержится в 800 мл элюата в концентрации 100 батраксобиновых единиц на мл. Выход в пересчете на нанесенные 112 000 батраксобиновые единицы (ВО) составляет 71,4/. Элюат концентрируют на ультрафильтре (01 ат 1 овещЬгап ОИАя 1 соп) на 80 мл, после чего он служит в качестве концентрата батроксобина для получения фармацевтического препарата с содержанием батраксобина в объеме 22 единиц на миллилитр для терапевтического дефиброгенирования. П р и м е р 2. 0,1 г яда змеи вида Ад 15 сгодоп сопогсг 1 х растворяют в 1,5 мл водного 0,1-молярного буфера на основе глицина/гидро- окиси натрия при рН 6,0. Раствор загружают в колонну (17 х 70 мм, 16 мл) из гепарин-сефарозы. Колонну домывают тем же буфером до тех пор, пока сливаемая промывная жидкость при 280 нм.11 94не показывает поглощения света, Затем колонну пропопаскивают 0,1-молярным глициновым буфером со значением рН 6,0; содержащим 0,75 моляхлористого натрия на литр, до техпор, пока иэ колонны больше не вымывается какое-либо количество поглощающего Уф-лучи продукта. Этот содержащий балластные продукты элюат выбрасывают. Затем путем элюирования сприменением 0,1-молярного глицинового буфера со значением рН 6,0 и содержащего 1,0 моля хлористого натрия на литр выделяют тромбинообразный фермент. Получают 22 мл элюатас коагулирующим действием на фибриноген. Согласно измерению на синтетическом хромогенном субстрате ( бенэоил-Рго-РЬе-АГ 9-И-нитроанилиде) активность в общей сложности составляет 6996 миллиединиц, Общее процентное содержание активного элюатасоставляет 6,2. Очищенный таким образом тромбинообразный фермент из ядазмеи Ац(15 годоп сопогт.г 1 х показывает при электрофорезе на полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия одну единственнуюзону; при испытании на ненагретойфибриновой пластине обнаруживаютотсутствие фибринолитической активности, Затем концентрируют на ультрафильтре (01 аГДопеоЬгап ОИ,Авсоп) до обьема 1-2 мл. В концентрат добавляют 150 мг дактозы,затем. разбавляют дистиллированнойводой до 30 мл, разливают по пузырькам обьемом в 1,0 мл и лиофилизируют.Получают 30 пузырьков с содержаниемкаждый по 200 миллиединиц Фермента ввиде стабильного сразу же растворяющегося продукта. В этом виде препарат пригоден для исследования фибриноген-фибринового превращения в физиологических и патологических условиях. Предлагаемый способ позволяетна колонне для хроматографии объемом всего лишь 20 мл расщепить болеег сырого яда или эквивалентноеколичество предварительно очищенной фракции фермента, причем образуются тромбиноподобные ферменты высокой степени чистоты, Это соответствует приблизительно 40-кратной производительности ионообменной хроматографии на целлюлозных обменниках, примерно 400-кратной производительности гель-хроматографии и примерно 25-кратной производительности хроматографии по химическому родству на и-аминобенз-амидин-сукцинил-диаминодипропиламиноагароэе, Эта сильная способность образовывать связи нерастворимого гепарина не только повышает производительность расщепления относительно небольшого устройства для хроматографии, но и обеспечивает то, что активные фракции элюата содержат фермент в значительно более высоких концентрациях по сравнению с ионообменной гельхроматографией, вследствие чего значительно сокращается трудоемкость операций концентрирования и обессоливания элюатов, Согласно предлагаемому способу тромбиноподобные ферменты из змеиных ядов получают эа небольшое число операций, легко проводимых, в большой степени автоматизирующихся и хорошо регистрируемых. Применение токсичных элюентов не нужно. 30 6389 12целях удаления балластного материала0,01-молярным глициновым буфером созначением рН 6,0, содержащим 0,25 моля хлористого натрия на литр. Получают 120 мл этого раствора с содержанием 27 единиц Апогод на миллилитр.Этот продукт показывает при электрофореэе на полиакриламидном геле вприсутствии додецилсульфата натрия 0 одну единственную зону.50 55 П р и м е р 3 , 0,1 г яда змеи вида Ац 11 эт.гос 1 оп г 1 ос 1 озтопа растворяют в 1,5 мл водного 0,01-молярного глицинового буфера со значением рН 6,0, Раствор загружают в колонну (17 х 70 мм, 16 мг) из гепарина-сефарозы, осажденную тем же буфером. Затем ее промывают тем же буфером до тех пор, пока с помощью фотометрического расходомера в элюате больше нельзя обнаружить поглощающий УФ-лучи продукт. Затем колонну элюируют в Формула изобретения Способ получения тромбиноподобных ферментов путем хроматографии змеиного яда, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа, змеиный яд в водном растворе или в буфере рН 4-10 с содержанием 0,01- 0,5 моль на литр хлористого натрия. обрабатывают гепарином, иммобилизи1 9638рованным через аминогруппы на инертномносителе,и выделяют целевой продукт,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 9 111. НоИеаап апд Ие 1 зз, Ехгасй 1 оп апд 1 зо а с 1 оп о 1 ТЬ гоп Ь 1 и 31 1 е Епупаз. Э, В 1 о 8. СЬещ. 1976, 252,1663- 1669.Составитель С. МалютинаРедактор В. Данко Техред Т.фанта Корректор " ГРиценкоЗаказ 535 /7 Тираж 71 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. Й/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,