Способ получения эндонуклеазы-рестриктазы, расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 =g cgc=3

диентом НаС 1 при изменении концент-. - рации от 0,.1 до 0,8 И при хроматограФии на фосфоцеллюлозе и градиентом0,0-1,0 М при хроматографии на гепаринсефароэе и голубой сефарозе.Используемый штамм НаешорЬд 1 цэ дп Г 1 цепгае .КГЬ 6 обладает следующими морфологическими, физиологическими и культуральными признаками.Коккобациллярные клетки. Грамм- отрицательные, неподвижные, бескапсульные требует для роста Х и 7факторов на плотных средах Формируют прозрачные мелкие колонии; гемолиэ 1, отсутствуетШтамм образует уреазу, расщепляет ксилозу, образует индол, не имеет р-галактоэидазы и не утилизирует орнитинНа агаризованном экстракте мозга20 и сердца теленка после 24 ч инкубации в термостате при 37 С образует мелкие, круглые, с ровными краями колонии. Колонии гладкие, блестящие, с агаром не срастаются, В мясо-ментонном 25 бульоне культура не размножается, Оптимальная температура роста 37 С.Затем проводят очистку рестриктазы Нхппутем хроматографии на фосфоцеллюлозе, гепаринсефарозе и голубой сефарозе в 10 мМ калийфосфатном буфере, рН 7,4, содержащем О, 1 мМ ЭДТА и 10 мМ 2-меркаптоэтанола, с элюцией фермента градиентом ИаС 1 О, 1-0,8 М при хроматографии на Фосфоцеллюлозе и 0,0-1,0 М БаС 1 при хроматографии на гепаринсефарозе и голубой сефароэе, Апробированы четыре способа получения рестриктазы: Фосфоцеллюлоза, гепаринсефароза фосфоцеллюлоза, голубая сефароза; Фосфоцеллюлоза, гепаринсефароза, ДЭАЭ-целлюлоза; Фосфоцеллюлоза, гепаринсефароза, голубая сефароза, Только в последнем случае при использовании голубой сефароэы на третьей стадии очистки до стигается наиболее эффективная очистка рестриктазы, а полученный ферментный препарат по качеству и етабильнс сти удовлетворяет всем требованиям,предъявляемым к ферментам как аналитическим реагентам.П р и м е р 1. Последовательностьопераций культивирование штамма и получение биомассы, выделение и очистка рестриктазы:разрушение клеток, 55хромотография на фосфоцеллюлозе, хромотография на гепаринсефарозе и хроматография на голубой сефарозе. Для размножения и культивирования штамма используют сердечно-мозговой экстракт (Вгадп Неаг Тпйцздоп "РИ- со") с добавлением Х и У факторов. Питательная среда в своем составе содержит 3,77. экстракта мозга и сердца теленка, 0,023 никотинамидадениндинуклеотида (НАД) и О, 1 Х гемина, рН 7,0, Сердечно-мозговой экстракт стерилиэуют при 1 атм в течение 20 миноЭ раствор гемина - при 70 С в течение 1 ч, раствор НАД " стерилизуемой фильтрацией.Штамм Н, дп 11 цепгае КРЬ поддерживают в лиофильно высушенном виде при 4 С. Криозащитную среду для хранения культуры готовят отдельно следующим образомф раствор сахарозы и желатины стерилизуют при 0,9 атм в течение 30 мин два раза через сутки и перед приготовлением бактериальной суспенэии в приготовленный стерильный раствор в асептических условиях добавляют такое же количество бычьей сыворотки.Для оживления культуры в две пробирки с питательной средой (сердечномоэговой экстракт, НАД и гемин) и две пробирки с мясо-пептонным бульоном (для контроля чистоты культуры) переносят лиофильно высушенную культуру, Пробирки инкубируют 18 ч при 37 С; Затем бактериологической петлей культуру повторно пересевают в две пробирки с питательной средой и мясопептонным бульоном и помещают на круговые качалки при 80-100 об/мин, Через 18-20 ч культивирования проводят третий пассаж - для непосредственно-го засева ферментера: по О, 25-О, 30 мл таким образом полученной суспензии клеток добавляют в две колбы с 0,25 мл каждой среды. Инокулят выращивают на термостатированных круговых качалках при 200 об/мин, 37 С в течение 18-20 ч, Оптическая плотность суспензии инокулята при длине волны 540 нм составляет 2,5-3,0 оптических единиц. Так полученный,инокулят засевают в лабораторный ферментер ВиолаФит", содержащий 10 л питательной среды. Культуру Н, пГ 1 цепгае КУЬ 6 выращивают при 37 С, рН 7,0-7,2 со скоростью перемевивания в первый час культивирования 150 об/мин и далее до 250 об/мин, а также подачей стерильного воздуха 3 л/мин в первый, час роста культуры, с постепенным увеличением до 5 л/мин на 6-м часу1576565 25 роста. Заданный рН во время выращивания культуры поддерживают добавлением насыщенного раствора бикарбонатанатрия,Во время культивирования периоди 5чески отбирают пробы и измеряют оптическую плотность суспензии клеток,Культивирование штамма проводят допоздней логарифмической фазы ростаоптическая плотность суспензии клетоксоставляет 2,2-2,5 о.е. (длина волны540 нм).Культуральную жидкость охлаждаютдо 4"С и центрифугируют на проточнойцентрифуге типа ЦЕПА при 2,5 10 об/минПолученную биомассу хранят при -20 С,Выход сырой биомассы 2,5-3,0 г/л культуральной жидкости.При разрушении и хроматографии 20используют буферный раствор (Б):10 мМ калийфосфатный буфер, рН7,4, содержащий 0,1 мМ ЭДТА и 10 мМ2-меркаптоэтанола. Активность рестриктазы тестируют методом гидролиза ДНК фага лямбда с последующим разделением полученных фрагментов электрофорезом в агарозном геле. Реакционная смесь для гидролиза ДНК фага лямбда рестриктазой Нхп 61 содержит 10 мМ трис-НС 1, рН 8,5, 50 мМ ИаС 1,3 мМ МяС 1, 1 ООмкг/мл альбумина бычьей сыворотки, 2 мкг ДНК фага лямбда в 40 мкл смеси и 5 мкл фермента. Реакцию проводят при 37 С 10 мин, Электрофореэ проводят в 0,1 М натрийборатном буфере, рН 8,2 с 2 мМ ЭДТА в течение 2 ч при напряжении 100 В и силе тока 100 мА. Окрашенные этидийбромидоммкг/мл) гели про 40 сматривают в УФ-свете.За условную единицу активности принимается то количество фермента, которое в оптимальных условиях за 1 ч полностью расщепляет 1 мкг ДНК фага лямбда.Все операции по выделенно и очист.о ке Лермента проводят при 4 С.Разрушение клеток.5020 г биомассы:, полученной. при культивировании Н.1 пГ 1 цепзае КГ 1. 6, сус-. пендируют в 60 мл буфера Б, содержащего О, 1 М ИаС 1, обрабатывают ультразвуком надезинтеграторе УЗДНТ в55 течение 10 мин н центрифугируют при 20000 об/мин на центрифуге Бекман Ж 21 Ц, ротор Ж.ХромотограЛия на Лосфоцеллюлоэе Полученный бескле точный экстракт со скоростью 30 мл/и наносят на колонку 2,5 10 см с фосЛоцеллюлозой, уравновешенной буЛером Б, содержащим О, 1 УНаС 1, Колонку промывают 120 мл того же буЛера и элюируют линейным градиентом ИаС 1 от 0,1 до 0,8 М в 500 мл буЛере Б.Фракции, элоируемые при 0,52-0,62 Я МаС 1, содержат основную часть активности. Их объединяют и диализуют в течение 16 ч против 2,5 л буфера Б.ХроматограЛия на гепаринсефароэе.После диализа раствор фермента центрифугируют при 20000 об/мин на центриЛуге Бекман 7-21 Ц, ротор ЖА.Полученный супернатант со скоростью 20 мл/ч наносят на колонку размером 1,510 см с гепарннсефарозой, уравновешенной буЛером Б, промывают этим же буЛером (40 мл) и элюируют линейным градиентом концентрации ИаС 1 от О,О-до 1,0 М в 80 мл буфера Б. Фракции, элюируемые при 0,74-0,86 М МаС 1, содержат основную часть рестркктазной активности. Их объединяют и диализуют в течение 16 ч против 1 л буфера Б.ХроматограЛия на голубой сефарозе,Ферментный раствор после диализа со скоростью 20 мл/ч наносят на колонку размером 1,5 х 8 см с голубой сефарозой, уравновешенной буфером Б, промывают 40 мл того же буЛера и элюируют линейным градиентом концентрации ИаС 1 от О,О до 1,0 М в 160 мл буЛера Б. Фракции, элюируемые при 0,5- 0,6 М ИаС 1, объединяют и ферментный препарат концентрируют путем диализа против буЛера Б, содержащего 0,1 М ИаС 1 и 507. глицерина (по объему).о Ферментный препарат хранят при -20 С. Из биомассы получают 15000 ед. активности рестрнктазы Ндпб. Формула изобретен ия Способ получения эндонуклеазы-рестриктазы, расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 -С СССпредус 1 Фматривающий культивирование продуцента, разрушение клеток, с последующей постадийной хроматографической очисткой, о т л и ч а ю щ и й с я тем, .что с целью повышения выхода и качества целевого фермента, в качестве микроорганизма " продуцента используют1576565 Составитель В.Варламов Техред Л,Сердюкова Корректор А.Обручар Редактор Н.Рогуличг Заказ 1830 Тирак 489 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.укгород, ул. Гагарина, 101 штамм НаешорМ 1 па Ы 21 пепгае ВКПИ В 4275, первую стадию хроматограФической очистки проводят на ФосФоцеллюлоэе 111 в калийФосФатном буФере,рН 7,4"7,5, с элоцией Фермента .градиентом ЮаС 1 0,1-0,8 и, вторую осуществляют на гепаринсеФарозе в том же буФере с элюцией Фермента градиентом ЮаС 1 0,0" 1,0 М, а окончательную очистку проводят в том же буФере на голу- бой сеФарозе с элюцией Фермента градиентом ВаС 1 , 0,0-1,0 М.