Способ получения полипептидов

ОП ИКАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик(33) Япония Гасударственный камитеСовета Министров СССРао делам изааретеннйи открытий(43) Опубликовано 25,10,77,Бюллетень39 (45) Дата опубликования описания 11.11.77 53) УДК 547.964.4.О 7(С 8) Иностранцыудзино, Мицухирэ Ва и Эйичиро Исикава (Япония) 72) Авторы изобретен Иностранная фирмаа Кемикал Индастриз Лтд(71) Заявитель СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ слотытный остаНН, Тр КН атэк тирознль Изобретение относится к способу получения полипептидов, которые могут найтиприменение для лечения недостаточности липидного и углеводного обменав частностидля лечения сахарного диабета,В органической химии известны различные приемы и методы конденсации, применяемые для образования пептидной связи,например карбодимидный, метод активирэванных эфиров, твердофазный синтез,Использовав известные методы синтеза,варьируя комбинации зашишенной и активированной форм карбэксильной и аминогруппв исходных соединениях, получают новыеполипептиды, обладаюшие ценными фармакэлогическими свойствами.Предлагается способ получения полипеп -тидов обшей формулый - Агу -йа - РЬе -РЬ- Вз,где Я - атом водорода или остатск основной нли нейтральной аминэкиЙ - нейтральный аминокисло2ток; масу, Сигехпсв Такетоми ного пептида, содержащего в своем составеот 1 до 5 аминокнслотных остатков, илностаток амида тирозпльного пептида прпусловии, чтэ, когда К представляет собой5 атом водорода, К 1 -у Рр О,заключаюшийся в том, что аминокисп:ту,соответствуюшую Р , нли аргинин в тэмслучае, когда К представляет собой атэк 1вэдорода, илн пептидный фрагмент пэлипепщ тнда указанной формулы, содержаший амин- кислотный остаток й или аргннильную группу в том случае, когда Р представляетсобой атом водорода, в качестве :Н -концевой аминокислоты, конденсируют с недэц стаюшим фрагментом полипептида указанной формулы, причем каждое нз исходныхсоединений может быть защищено по своимаминс- и карбокспльным группам, которыене должны принимать участия в кэнденсаЗт ции, и может быть активировано по темамино- или карбэксильным группам, которые непосредственно участвуют в указаннойреакции кэнденсацтп и после завершенияконденсации эти группы удаляют из полу 5 ченного лолипептидногэ продукта, 577075 22ствии палладиевэй черни в течение 4 ч.Катализатор этфильтрэвывают, а фильтратконцентрируют досуха при пониженном давлении. Остаток растворяют в 15 мл ДМФ.К раствору прибавляют 492 мг ХАООЭГ (80) Рго-ОН и 200 мг НОЙВ, эхлажцают и в реакционную массу вводят 250 мгДЦГКДИ, Полученную смесь перемешивают вв течение 18 час. Нерастворившиеся примеси отфильтровывают и ДМФ отгоняют припониженном давлении. К остатку прибавляют этилацетат, осадок отфильтровывают исушат дэ постоянного веса. Сухой продуктрастворяют в 10 мл трифторуксусной кислоты, Раствэр оставляют стоять на 40 мин цзатем трифтэруксусную кислоту отгоняютпри пониженнэм давлении, остаток растворяют в 30 мл ледяной уксусной кислоты.Восстанавливают в присутствии палладиевойчерни в течение 16 ч. Катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают досуха припониженном давлении, Остаток растворяютв 10 мл воды и раствор пропускают черезколонку с Амберлитом УЯ А, Растворфильтруют, фильтрат вводят в хроматографюческую колонку (2,2 х 30 см), заполненную карбоксиметилцеллюлозой. ГрадиентЮую элюцию проводят с использованием0,005 и 0,2 М водных растворов ацетатааммония (по 800 мл каждого раствора), ЗОфракции эт 820 до 1180 мл обьединяют илиофилизуют. Получают 670 мг целевогопродукта в виде белого пушистого порошка.Аминокислотный анализ: 1-б 1,02; Д 1"0,98; ТЬг О,Е 6; РГО 2,04, Аа 1,00; 35Тг О,87; Р)7 Е 2,02; -АГа 1,О 5(содержание пептида в образце 74%).П р и м е р 17. Получение 6 - Иа -- Й- Фу - РЬе - РЬе - Туг - )еи - ОИ.А. Синтез 1-Рпе-рпе -Тг-ОЕ 1,3,43 г 2 - Р М - Тз г - 0 Ю растворяютв 50 мл этанола и гидрируют в присутствии палладиевой черни в течение 3 ч.Каталчзатор отфильтровывают, раствор упа 45ривают досуха при пониженном давлении.Остаток растворяют в 15 мл ДМФ и к раствору прибавляют 2,77 г,.-РИе - ОэдРеакционную смесь перемешивают в течение10 ч, добавляют 80 мл воды, образовавший 50ся при этом кристаллический продукт отфильтровывают и перекристаллизовывают изсмеси этанол/этилацетат/этиловый эфир, Получают 3,72 г (83,4% эт теоретического)указанного пептидного производного в видеигольчатых кристаллов с т.пл. 185-186 С,оА -18;1 (с = 1,09%; ДМФ),Найдено,%: С 69,64; Н 6,14; ч 6,54.С Н 0 я37 3% 7 3Вычислено,%: С 69,68; Н 6,1.6; М 6,59 60 Б, Синтез Е - 8 - - Л(э4 г (од)-6 Ь - Рпе - Р 6 - ТугОь 1.В 50 мл этанола суспендпруют 2,0 г-РИС-РМ-"Ъг-ОИ и в течение 1,5 чпроводят его каталитическэе восстановление в присутствии палладиевой черни. Катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают в вакууме с целью этгэнки растворителя. Остаток растворяют в 20 мл ДМФ.К полученнэму раствору, охлажденн. му наледяной бане, прибавляют 1,56 г с. - - АГсм- А(т(Й 0 )-Яз - 0 Н 0,7 г НОМ Ви 0,8 г ДЦГКДИ и смесь перемешивают втечение 12 ч. Образовавшуюся ДПГМ отфильтровывают, раствор упаривают при пэниженнэм давлении и к остатку прибавляют60 мл волы. Полученное при этом порошкообразное вещество отфильтровывают, сушати пересаждают из смеси ДМФ/этилацетат.Выход продукта 2,58 г (82% эт теэретичесхэгэ), т.пл. 83-85 эС; (э(,1 -10,0 э(с = 1,1%; ДМФ).3Найдено,%: С 57,41; Н 6,05; Ч 14,4 ЕВычислено,%: С 57,43,Н 6,23, М 13,97С. Синтез У - / - А 1 а - 1(ЙОу) -- С у - РВ е - Рп е - Туг - ОИ,К охлажденной льдом суспензки 2,00 гзащищенного пептида Е - ,4 - ИаАг (М 0) --6 у - РЬе - РЬе -Туг- ОЕ( в 30 мл лпетэпнприбавляют 6,3 мл 1 М водный растворгидроокиси натрия, смесь перемешиваютпри комнатной температуре в течение 1 ч,После добавления 3 мл 1 н. соляной кпс -лоты ацетон отгоняют при пэнккеннэм давлении. Незначительное количество нерас творившегося вещества отфильтровывают ик фильтрату прибавляют 3,8 мл 1 н. сэпяной кислоты. Выпавший при этэм осадокотфильтровывают, тщательно промывают холодной водой и сушат, Выход продукта1,96 г (Е 8% от теоретического), т.пл.продукта 70-73 С, АЗ -8,7 э (с =0,97%;ДМФ) .Найдено,%: С 58,13; Н 5,8 Е; М 14,5146 Н, 02 И,О Н 2Вычислено,%:С 57,77, Н 6,90, К 14,64Де Синтез У,ф - А(с - Агя (ЯО) - 63.- Рбе - РЬе - Ту - 1.ец - ОВЕЙ.В 5 мл ДМФ растворяют 275 мгН-еи- ОВ 1 -о -толуолсульфоната,раствор нейтрализуют О,Е мл 10%-нэгэраствора М -этилмэрфэлина в ДМФ. В реакционную смесь, охлажденную дэ -10 эС,последэвательнэ вводят 670 мг 7 - )Ъ - Агав Аг(МО,)- ВЬ -РЬг-Рпе-Тг мгНОТЧ В и 289 мг ДПГКДИ, перемешиваютв течение 12 ч, образовавшуюся Д 11 ГМотфильтровывают и ДМФ из фильтрата эт17 О 7 23гоняют при пониженном давлении. К остатку прибавляют 30 мл волы, полученный осадок отфильтровывают, промывают горячим метанолом и сушат. Выход продукта 703 мг (87,9% от теоретического); т.пл, 178-181 оС; А. -15,0 (с = 1,02%; ДМФ)Найдено,%. С 61,88; Н 6,78; И 13,157 1 ИВычислено,%:С 61,98, Н 6,35, Й 13,49Е. Получение 6 - Иа - Дгэ - 61 у - РИе - РЬе - Гр - Еец - Оц.В ЗО мл уксусной кислоты растворяют ЬОО мг К Р - Ац - ф Я (Н(,)2 д 1 - Рле- Р)1 е -Руг-Еец -ОВА и в присутствии палладиевой черни гидрируют в течение 8 ч. Катализатор отфильтровывают и раствори- тель отгоняют при пониженном давлении, Остаток растворяют в 5 мл воды и полученный раствор вводят в колонку (2,6 хх 18 см),1 заполненную карбэксиметилцеллюлозой, Злюцию осуществляют линейно- градиентным методом с использованием 0,005 М водного раствора анетата аммония (700 мл) и 0,2 М водного раствора ацетата аммония (700 мл). Целевое соединение собирают во фракциях от 370 до 720 мл. Эти фракции объединяют и лиофилизуют. Выход продукта 277 мг (64,2% от теоретического), д." -32,5 э (с = = 0,51%; вода).Найдено,%: С 55,80; Н 7,20; М 14,17С Н ОИ СН О ЗИС 5 1 О 15 20 25 ЗО З 5 40 45 50 55 80 Вычислено,%:С 55,97; Н 7,15; М 14,19Аминэкислотный анализ: А 11,00; 6 У1,04; (,Вц 1,08; р 1 е 2,16; ТУг 0,88;- А 14 1,04 (содержание пептида 85,9%)П р н м е р 18. Получение ф. - Я(о --Арр - Жу - РЬ е - Р 1 е - Туг - Мс - М Н .Методику, описанную в примере 17 воспроизводят с тем отличием, чтэ вместоИ"1 еО - С 1 ВМ в г 1 -тэлуэлсульфэната пспользучот Б- А 1 а- ИН 2 -гидрохлэрид. Витоге получают целевой гепрапептид - А 0 с - Ау(.- д РУ ЬО- РИе-Туг-а- КН-диацетата с выходом 216 мг.Лминэкислэтный анализ: АЬД 1,01;1,00" ,Ис 1 1,02 РЬе 2,00; ТУг 0,89Ао 1,12 (сэдержание пептида в образце 82,4%),П р и м е р 19. Получение 6 - Иа - -Й- С 1 у - Р 1 е - РИ,е - Туг - ТЬг - Рго - ОН.А, Синтез 2 р М-РИАЗ-ТУг - Тбг -Р 1 а 018 ц .1,80 г 2- ТЬ - Рга - 0130 растворяют в 30 мл метанола, гидрируют в течение 5 час в присутствии паллядиевэйчерни. Катализатор отфильтровывают, а растворитель этгэняот при пониженном давлейии. Остаток растворяют в 20 мл ДМФ,раствор охлаждают дэ -10 эС и при перемешивании и охлаждении последовательноприбавляют 2,70 г Е- РЬе - рИе-ТУг- ОН,1,59 г НОЯ В и 1,37 г ДЦГКДИ. Реакционную смесь перемешивают в течение 18 чобразовавшуюся ДЦГМ отфильтровывают ик фильтрату добавляют 100 мл воды, Осадок отделяют фильтрованием, промывают,суша и растворяют в 100 мл этилацетата.Полученный раствор дважды промывают50 мл воды и сушат над безводным сульфатом натрия. Раствэритель отгоняют в ва,кууме, а к остатку прибавляют этилацетат.Образовавшийся,при этом порошкээбразныйпродукт переносят на фильтр и сушат, Выход продукта 2,51 г (89,8% от теэретическэго); т.пл. 137-139 С; 1 А 1 -441(с =. 1,08%, ДМФ),Найдено,%: С 65,49; Н 6,82, И 7,91С И ОИ Н ОВычислено,%:С 65,36, Н 6,74; М 7,94Б, Синтез у- А 1 а - Лгя (И 02) - МУ -Р 1 е - РЬе - Туг - ТЬг - Рго - 01 ВП .В 20 мл метанэла растворяют 1,50 гЕ- Р 11 Е -Рпе-Ту -Р 1 о - 01 Ви,гидрируют в течение 4 ч над палладиевойчернью. После этого катализатор этфильтрэвывают, фильтрат упаривают досуха припониженном давлении. Остаток растворяютв 10 мл ДМФ, раствор охлаждают в ледяной бане и прибавляют при перемешивании0,87 г 1-- А 8 с( - А 1 фД(ИО 1-60 У-ОН,0,47 г НОр(В и 0,54 г ДЦГКДИ. Реакционную смесь перемешивают в течение16 ч, образовавшуюся ДЦГМотфильтровывают, к фильтрату добавляют 50 мл воды.Образовавшийся гелеобразный осадок отфильтровывают, высушивают и переэсаждают вначале из смеси ДМФ/этилацетат, затем из этанэла. Выход продукта 1,40 г(67,4% от теоретического), т.пл. 153156 С Я 32 Зо (с = 0 97% ДМФ)Найдено,%: С 58,24; Н 6,54, Я 13,87Вычислено,%: С 58,50; Н 6,5 7; й 13,88С. Получение В - Ащ - Ьгд - 6 у --- Р 11 е - РЬе - Туг - ТЬу - Рга - ОНК 900 мг Е - ф - А(а - ЛГЦ И 02) -- С у - Р)е - РЬе - "1 г - ТЬ - Рга - 0(виприбавляют 0,9 мл анизола, 10 мл безводного фтэристэгэ водорода, реакционнуюсмесь перемешивают при температуре -4 Св течение 30 мин, фтористый водород этгэняют при пониженном давлении и к остатку прибавляют 30 мл воды, Растпэр экстрагируют 30 мл диэтилэвэгэ эфира и вэд40 29пониженном давлении. Остаток обрабатывают петролейныьГ эфиром, выпавший осадок отфильтровывают. Выход продукта 2,3 г 93% от теоретического) ф, т.пл. 64-67 оС; 11 -75,58 о с = 0,995%; метанол).Найдено,%: С 59,25;Н 7,59; Н 9,65М 5 10 6Вычислено,%: С 59,55; Н 7,85, М 9,92Д. Синтез Г- РЬе - РЬе - Тр - ТЬг -- Рго - 1,ув (ВОС) - Ла - 01 Вп.101,41 г - ТЬГ-Рго- чьСВОС)-дЕо- Р 1,ВО, растворенные в 70 мл метанола, гидрируют над палладиевой чернью в течение 2 ч. Катализатор отфильтровывают, растворитель упаривают при пониженном давлении. Остаток растворяют в 10 мл ДМФ н к раствору прибавляют 1,1 г 2-.РЙ 6- г 116- "Тчг - ОН и 720 мг НОКВ, Затем при охлаждении на ледяной бане к раствору прибавляют 618 мг ДЦГКДИ и реакционную смесь перемешивают в течение 20 ч. После этого растворитель отгоняют при пониженном давлении, остаток обрабатывают смесью этил/ацетат/эфир ( 1:1), Образовавшееся при этом порошкообразное вещество отфильтровывают и перекрнсталлизовывают из этанолв. Выход продукта 2,1 г (100% от теоретического); т.пл. 160- 163,5 С А 1) -63,73 о (с = 1,05%, ме танол).Найдено,%: С 62,02; Н 7,14, М 9,64ьг Нво 016 4 вВычислено,%: С 62,09, Н 7,23, .Ч 9,34Е. Синтез У Йд НОВ) - Юу - Р 1 е -- РЬе - Ъг -ТИг- Рго - Еув (ВОС) - Ма - 0 Ва.2,32 г. 2- РИе-Р 11 е -Ьг-ТЬ-Иго- М ВОС)- Ага-ОСВц, растворенные в 1 30 мл метанола, гидрируют над палладиевой чернью в течение 3 ч. Катализатор отфильтровывают и упаривают досуха при пониженном давлении. Остаток растворяют в 5 мл ДМФ и к полученному раствору прибавляют 1,26 г Е- Агг(йбг)- ЬЬ-ОМЪ Реакционную смесь перемешивают при ком нвтной температуре в течение 20 ч, после чего ДМФ отгоняют прн пониженном давлении и остаток обрабатывают 50 мл воды. Выпавший осадок отфильтровывают, дважды переэсаждают из смеси ДМФ/вода. ээ Выход продукта 2,5 г 88% от теоретического); т,пл, 138-141 оС разложение), с.3.р 32,4". (с = 0,99%, ДМФ).Найдено,%; С 58,8; Н 6,80, М 13,6655то 9 ь 18 14Вычислено,%; С 59,14, Н 6,81; Й 13,80Ж. Получение ю - Аа - Аго - Фу - РЬе - Р,1 е - Рр - Т 1 г - Рго - .уз - Ма - ОЯ,В 30 мл смеси метанола и ледяной ук О 30сусной кислоты (2:1) рдствэртот 710 мг 2- Агу(КО )- Ьч-Рпе- Рпе-Тчг- ти 2-р о чь ВОЮ)-А 1 й-ОСЬЮи в присутствии палладиевой черни восстанавливают в течение 8 ч, Катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают досуха при пониженном давлении. Остаток растворяют в 10 мл воды и раствор пропускают через хроматэграфическую колонку объем 130 мл), заполненную кврбоксиметилцеллюлозой. Элюцию осуществляют градиентным методом с использованием 0,005 М водного раствора ацетата аммония (800 мл) и 0,2 М водного раствора ацетата аммония 800 мл). Фракции от 913 и до 1190 мл объединяют и лиэфилиэуют, Получают 350 мг белого пушистого продукта, который растворяют в 8 мл ДМФ, к раствору прибавляют 41 мг моногидрата П -гэлуэлсульфокислоты, затем туда же 82 мг ВОС- Р - АЕ- ОЙВ, и реакционную смесь перемешивают в течение 16 ч. ДМФ отгоняют при пониженном давлении и к остатку прибавляют 3 мл трифгоруксуснэй кислоты. Смесь перемешивают в течение 30 мин, трифторуксусную кислоту отгоняют в вакууме. Остаток растворяют в 10 мл воды, пэлученньй раствор пропускают через колонку (1,0 к х 10 см) с Амберлнтом УА -410 (в ацетатной форме). При прохождении через колонку с этим внионитом вещество превращается в ацетат. Элюат лиофилиэуют и вводят в колонку (2,2 х 17 см), заполнен- ную карбоксиметилцеллюлээой, Элюцию осуществляют градиентным методом с использованием 0,005 М водного раствора ацетата аммония 500 мл) и 0,2 М водногэ раствора ацетата аммония (50 мл). Фракции от 430 до 500 мл объединяют и лнэфилизуют. В результате получают 250 мг белого пушистого вещества с с 1 -58,8 ог 4 3 (с = 0,5%) вода).Аминокислотный анализ: Ьчь 1,00; Агг 1,04; ТЬг 1,00; Рго 1,04; 61 ч 1,04; АГО 1,04; Тчг 0,89; РЬе 2,00;" АЗУ 0,93 содержание пептида 72%),П р и м е р 23. Получение Ич- Агд ЕЧ-РЬЕ-Р)1 Е-ТчГ-ТИг-Рго чь- АСс 1-0 Н.Воспроизведена методика примера 22, но вместо ВОС- Ъ -А 1 О- ОМВ используют ВОС- Мч - ОМВ и получают 214 г упомянутого сэединения в виде белого пушистого продукта; А 1 -59,2 э (с = 0,4%; вода).Аминэкислэтный анализ: 1.ч 5 1,02; АЩ 1,00; ТВг 1,00, Рго 1,01; Ич 2,00;Аг,О 1,03; ТЗг 0,87; Рпе 2,04 (содержание пептида 78%).577975 В реактор твердофазного пептидвогэ снн( ь 1 иа доз 800)- щвют 4,04 1 ВОС- Иу -смолы (содержащей 1,78 ммоль 98 у ) я оставляют набухать ее э хлорисгом метлене в тече 10 еяэ 20 ч. Затем по методу Меррифилдв вводят ИОС- Тэ 1(318)- ОК, ВОС- РИФ-ОН, ВОС Е -ОК, ВОС- аЬ -ОН, АаС -41 у(1"0)-ОН а Х - (ен -ОН в уи, ааиом порядке. В качестве кондеиснрув 1 щего агента применяют ДЦГКДИ, Каждую аминокислоту берут в четмрехкрвтном избытке, ВОС-группы удаляют с помощьв трифторуксусной кислоты в днхлорметане (1:1). Смолу извлекают иэ реактора промывают дихлорметаном, ДМФ, метанолом н уксусной кислотой, сушат. Получают 5,07 г смолы еБ. Приготовление Я - Ееи - Лгя (Тоз) -- сну- ЯЪе-РЛе -фг 9 И)-ОВу - Мйх,В 50 мл 17%-ного раствора щимиака в метаноае помещают 4,41 г смолы, полученной по примеру А, суспензив перемешнаввт в закрытом сосуде цри,комнатной температуре в течение. 48 ч, Смолу отфильтро вывают и хорошо промывают ДМФ. Фильърат н промывные воды объединяют и упаривввт при пониженном давлении. К маслянистому остатку, добавляют этиловый эфир выпавший осадок отфильтровьаают и промывавт эфиром. Выход 950 мг.В. Приготовление 1 ец- Агг-яЬ-РЬе-.Р)1 В-Ъ -Из- ИН .2В 10 мл безводного фтористого водорода растворяют 500 мг сырого защищенного пептнд-амида, полученного по примеру Б, н 0,5 мл анизола, раствор охлаждают до ОоС н перемешивают в течение 60 мин. фторнстый водород отгоняют, остаток растворяют в 50 мл воды. Раствор дважды экстрагируют 20 мл этилового эфира, водный слой пропускают через колонку(2 х 10 см с Амберлитом ЗЯА -410 (в ацетатйой форме) и лиофилизуют. Продукт помещаютв колонку (2,3 х 17 см), заполненную карЬ оксиметилцеллюлозой, н вымывают путем градиентного элюировання 0,005 М водным ацетатом аммония (400 мл), затем 0,2 М водным ацетатом аммония (400 мл). фракции 490 до 550 мл объединяют и лкофилизируют, Получают 167 мг указанного соединения в виде белого пушистого продукта.Аминокислотный анализ: Агу 1,02; бааз 31П р и м е р 24. Получение 3 яа - Агу Ву - УЬе - РЛе - Рр - оЬ - ВНЯА. Приготовление Е реп - Агц (Тов) -- 61 у - Р 1 а - Рйе - Туг И) - 01 у - смолы. 322,00; 1-ео 1,03; Т 0,89; Рпе 2,08-Оф - РЬе - РЬ е-Туг 9 И) - Ма - 0 у -смолыВ реактор синтеза (1 сзбы АР 5 8061помещают 3,03 г ВОС- баю -смолы (содержание ФЗ.м; 1,32 мм), и оставляютнабухать в хлористом метилене. Затем спомощьв симметричного ангидридного пропесса вводят ВОС- АИ -ОН, ВОС-Тг(ВЕ)-ОН, ВОС- РМ Он, ВОС- РЬе ОН,ВОСаев Иу щвОН АОс ев Агф(ТОб) нОН иХ Ь-Абсид ОН в укаэанном порядке Накаждой стадии НОС-защиту удаляют с помощьв 50%-ной смеси тряфторуксуснаякислотаlдихлорметвн.Кроме того, на каждой стадии неирореагировавшие аминогруппы ацетилируют ангидридом уксусной кислоты, После введения и реакцию всех аминокислот смолу промьпыют этанолом, ДМФ, дихлорметаном,уксусной кислотой в метанолом, сушат при5 пониженном давлении. Получают 3,70 гпептидной смолы.Б. Приготовление У-гб -Аа - Ьг ЪэЗ)- 01 у - РЛе - РИе.-Яг(ВгФ) -А(а - Иу - ЙН 2,В 3,28 г пептидной смолы, полученной0 по методу А, суспендяруют в 50 мл 17%ного аммиака в метаноле, в плотно закрытой склянке. суспензию перемешивают прикомнатной температуре в течение 40 ч.Смолу отфильтровывают н промывают 50 млзб ДМФ. Фильтрат и промывные воды объединяют и упаривают досуха при пониженномдавлении, К остатку добавляют эфир, выпавший осадок отфильтровывают, сушат,получают 433 мг сырого защищенного пеп 40 тид-амидаВ. Приготовление -АИ-, Аго - Иу-РИТ-Ь е-Ъ- Айр- Се- йн,В смеси из 8 мл безводного фтористоговодорода и 0,3 мл аниэола .раСтворяют,Ф 310 мг сырого защищенного пептид-амида,полученного по методу Б, раствор перемешивают при ОоС в течение 60 мин) фтористый водород отгоняют при пониженном давлении, остаток растворяют в50 50 мл воды, Раствор дважды экстрагируют10 мп эфира. Водный слой отделяют и наносят на колонку (1 х 10 см) с АмберлитомНА(в ацетатной форме), которуюзатем промывают водой.5 б Вытекающий поток н промывные водыобъединяют и лиофилизируют, сухой продуктрастворяют в 10 мл воды н наносят наколонку (2,3 х 17 см). с карбЬкспметилцеллюлозой. Градиентное эдюированне выпол 60 няют 0,005 и 0,2 М водными растворами577933япетятя аммония (4 Г)0 мл каждый).,Фракции эт 495 дэ 540 мл объединяют и лиэфилизируют, Получают 134 мг указанногопродукта;-19,62 о (с = 0,53%,вода),5Аминэкислэтньй анализ: А 1 д 1,05; 631,95; А 1 О 100, Тг 0,86, Рпе 1,98- Аб 1,02 (пептиднэе содержание 84%).Найдено,%; С 52,40; Н 6,55; Й 1565""Л"Р 1 ОВычислено, %: С 52,31; Н 6,91; Й 15,57П р и м е р 26, Получение Ю,- - Раув- А ря - щу - РЬе - РЬ е - Ту 1 - Иа - Оу - ЯИ .Воспроизведена метэдкка примера 25 заисключением того, чтэ вместо Й- - А 1 О- ОИ 5введена ди- Х - д,"-, АЬО - ОН -аминокислота, Получено указанное соединение в видебелого пушистого продукта; (с(.1 -20,3%21(с = 0,2%, Вода),Аминокислэтный анализ: АЯ 1,00; ОЬ1,89; АИ 1,02; Тзг 0,88, Рпе 2,00;д.,- АЬи 1,04 (содержание пептида 81,5%).П р и м е р 27. Получение ЙЬ-А 1 г -- 56-РИе-РЬе- Мн,А. Приготовление Х - М 3 - Д 1 г(ЙО 1-СЬ-РЬе-РИе- ВНК 0,80 г Х-Аг (ИО - Из-Р)1 е-РИЕЙН добавляют 8 мл 25%-нэй КВ(-уксусной кислоты, смесь хорошо взбалтывают при комнатной температуре в течение45 мин. В реакционную смесь добавляют100 мл эфира, полученный порошок отфильтровывают и высушивают в течение 2-х днейнад гранулями гидроокиси натрия в эксжаторе при пониженном давлении. Высушенный35продукт растворяют в 10 мл ДМФ, растворнейтрализуют тризтиламином. В раствор добавляют 0,43 г Х- О 3- ОЙВ, смесь перел 4 ешивают в течение 10 ч, затем добавляют407 мл воды и отделяют масло. После удаления супернатанта декантацией добавляют50 мл воды. Выпавший осадок отфильтровывают, высушивают и чистят переосаждениемиз смеси ДМФ/зтилацетат. Выход продукта0,66 г (774 от теоретического), т.пл.о45119 122 эГ 3. 11 24 6 о (с = 1 01%,ДМФ),Найдено,%: С 55,95, Н 5,90; И 17,73 50Вычислено,%: С 5551; Н 5,95; И 17,99Б. Приготовление 6 Р - А 1- СИ - Р 11 е-РЬе-Ин .а5 оо мг г-БЕЙ- Агдко,)-ЬЬ-РЬе= - РЬе - М Н растворяют в 30 мл ук 55суснэй кислоты и восстанавливают над палладиевой чернью в течение 7 ч. Катализатор отфильтровывают, уксусную кислоту отгоняют при пэниженнэл давлении. Остаток ряствэряют в 10 мл воды и раствор пропус 7534кают через колонку (1,8 х 10 см) с карбоксиметилцеллюлозэй.Элюирэвание выполняют методом линейного градиента, испэльзуя 0,1 М водныйраствор ацетата аммония (700 мл) и1 М водный раствор яцетатя аммэния(65%) белого пушистого продукта. дП17,7 э (с = 0,48%, вэда),Аминокислэтный япялиз (гидрэлиз с НИЬг 1,15; МУ 2,00; РЮ 2,00 (содержание пептидя 81,6%),Найдено,7, С 52,05; Н 6,85; Й 17,22Нз ОН 2 СНО 2 Н ОВычислено,%. С 52,Г)9; Н 6,97, М 1,09П р и м е р 28. Получение Э Аус- АГАСЬ-Рье -Р 1 е-нн,.А, Пригэтовление 7-2- АЮО-,Агя (М 01"Ю-Р)1 е -РЬе- Ян 2В 8 мл 25%-ной НВп -уксусной кислэты растворяют 0,8 Г г Е- Агр(МО 1-5 РчРЬЕ-РМ Н , раствор перемсчипвяют прикомнатной температуре в течеп 10 мин.Прэдукт осаждают, дэбавпг к с си 100 ллэтилэвэгэ эфира, эсадэк отфильтровывают.промывают эфиром и сушат. Сухой продуктрастворяют в 10 мл ДМФ, раствор нейтрализуют тризтпляминэм, после чего добавляют 0,51 г 7-3- АГс - 01 В Смесьперемешивают в течение 8 ч. ДМФ отгоняют при пониженном дава ниц, к остаткудобавляют 50 мл воды, Выпавший осадокотфильтрэвывяют,После высушивяния, порошок проламываютгорячим зтиляцетатом и переэся кпяют пзсмеси ДМФ/зтиляцетят, Выход продукта0,799 г (92% эт теоретического); тял.223-225 эС; сЛ -22,3 э (с = 0,98%,ДМФ).Найдено,%: С 56,38; Н 6,07; М 17,98Вычислено%; С 56,69; Н 6,04; )4 17,87В. Приготовление Э- А Вс - Аф д.- 61 ч -Р 11 е-.Рпе- Ин.600 мг 2-Э- Або - Агр К О ) - М-РИе-РМ- ИИ растворяют в 30 мл уксусной кислоты и восстанавливают в присутствии палладиевэй черни в течение 7 ч.Катализатор отфильтровывают растворительотгоняют при пониженном давлении. Остаток растворяют в 10 мл воды и растворпропускают через колонку (1,8 х 11 сл ) сарбоксиметилсефадексом.Линейно-градиентное злюирэвание выпэлняют 0,1 М водным раствором ацетатааммония (700 мл) и 1 М водным раствором ацетятя аммония (700 мл). Указанное:эединение выходит вэ фракциях эт 350ло 450 мл. Зти фракции объединяют и лиофилизируют. Выход 400 мг (73%) белогопушистого продукта; А 1 -22,2(с0,51%; вода).Аминокислотный анализ: Ау 1,01СВ ю1,03, Д 1 С 3 1,00; РМ 1,99 (содержаниепептида 82,3%).Найдено,%; С 52,66; Н 6,92", Й 16,82СН, ОН, гС,Н,О, гН,ОИМ 1 4 а 42 2 0Вычислено,%: С 52,72; Н 7,11; М 16,77П р и м е р 29. Получение М- Ар-Из-РНВ -9 Ье - МНА. Приготовление Х- РИ 6- А 1 Д(Й 02)- -бЬ- РЬе-РЬв-йН,.1 ЬВ 10 мл 25%-ной НВФ" -уксусной кислоты растворяют 800 мг Х.- АЬд(ИО 1 ИМ" РЬ 8-РИ 6" ЙН 2 раствор перемешивают в течение 50 мин. К раствору добавляют 80 мл эфира, выпавший осадок отфильтро вьвают, сушат и растворяют в 10 мл ДМФ, Раствор нейтрализуют триэтиламином, зачем добавляют 700 мг 2 РМ -ОРСР (пентахлорфениловый эфир). Смесь перемешивают в течение 10 ч, добавляют 50 мл 2 1 М водного аммиака. Маслянистый слой отделяют декантапией и туда добавляют воду. Полученный порошок отфильтровывают я сушат. Смешивают продукт с 50 мл зтилапетата, смесь подогревают, порошок отде- ЗО ляют фильтрованием в,горячем состоянии и чистит переосаждением из смеси ДМФ/этилапетат. Выход продукта (805 мг (92% от теоретического);1 сЦ -29,0 о 1 с = 1,0%, ДМФ) .Найдено,%: С 60,32; Н 6,02; Й 16,10С 4 Н -о О 90Вычислено,%; С 60,06; Н 5,98; М 16,29В. Приготовление РИС- АуЬ- РИе --РЬе- ин,2В 6 мл безводного фтористого водорода растворяют 500 мг Е-РЬе-Агг(ИО 12 45 -66-РЬе-РЬе- МН и раствор перемешивают при -10 оС в течение 40 мин, Фтористый водород отгоняют, а остаток растворяют в 10 мл воды. Раствор пропускают через колонку (0,9 х 15 см) с Амбернитом 1 ЙАС (в ацетатной форме), который предварительно промыт водой, Вытекающий поток (эфлюент) объединяют с промывными водами и смешанный раствор лиофилизируют. Получают 402 мг указанного соединения.55Аминокислотный анализ; Ь 1 х 1,01; ИЪ 0,98; Р)6 2,94, (содержание пептида 86 2%)П р и м е р 30. Получение Йо- Аг - -ЬЬ-РЬе-Рпе-Ччг-йи .г А, Приготовление Х-АгД(МО )- С 1 з-РЬЕ 2-РВе-Тг- МН 2,В 100 мл ДМФ растворяют 12,2 г7 Е " ф Т- К 2, гидрируютв присутствии палладиевой черни в течение5 ч. Катализатор отфильтровывают и добавляют 8,6 г 4" А(,ИО )-ЦЬ-ОН н 1,3НОЙ В.Реакпионную массу охлаждают льдом идобавляют 4,95 г ДЦГКДИ. Смесь перемешивают в течение 12 ч,Образовавшуюся ДЦГМ отфильтровывают,в фильтрат добавляют 1 л воды. Полученный гелеобразный осадок отфильтровываюти переосаждают из метанола и воды, Выходпродукта 16,25 г (91,8% от теоретическо 24го); т.пл, 181-184 оС;Щ. -16,0 (с=1,01%; ДМФ).Найдено,%: С 58,02,Н 5,98; Н 15,66С 4 о 0 М 1 М 20Вычислено,%: С 58,35, Н 5,92, М 15,83Б. Приготовление А д-Иу-РНе-РИе"Т -НН600 мг Х.г(ЙО 1 "3 Ь -РЬе-РИе 2ТмГ МИ 2 растворяЮт в 30 мл уксуснойкислоты, гидрируют в присутствии палладиевой черни в течение 9 ч. Катализаторотфильтровывают, растворитель отгоняютпри пониженном давлении. Остаток растворяют в 15 мл воды и чистят, пропуская через колонку (1,3 х 11 см) с карбоксиметилсефадоксом, Линейно-градиентное алюирование выполняют 0,1 М водным растворомапетата аммония (500 мл) и 1 М воднымраствором апетата аммония (500 мл). Фракпии от 250 до 420 мл объединяют и лиофилизируют. Выход продукта 416 мг ( 72,5%от теоретического); Щ -7,6 о (с =0,4%;вода),Найдено,%; С 55,81; Н 8,83; М 14,78НИО 6 (9 2 С 2 Н 402 2 Н 20Вычислено,%; С 55,37; Н 7,03; Й 14,90Аминокислотный анализ; А )1,02; Иу1,00; Т 0,91; РВЕ 2,02 (содержаниепептида 82,5%),В. Приготовление 2" .Е О - А Гг ( М 02)- -И-РпЕ-РЬе -тг- МНгК 700 мг Х-Ау(МО )- бич-РЬе-Тпе"Тг-ЙН 2 добавляют 0,2 мл анизола,7 мл 25%-ной НВФ -уксусной кислоты.Смесь встряхивают при комнатной температуре в течение 40 мин, затем добавляют100 мл этилового эфира. Выпавший осадокотфильтровывают, сушат и растворяют в10 мл ДМФ. Раствор нейтрализуют тризтиламином и добавляют к нему 344 мг .Е- ен - Обы ( й -оксисукпннимидный эфир).Смесь перемешивают в течение 12 ч. ДМФперемешивают в течение 6 ч и образовавшуюся ДЦГМ отфильтровывают. Фильтрат добавляют к полученному по описанной методике аминокомп оненту ( Н- Р пе - Р Й е - Т ч г -- Н а ), после чего смесь оставляют наночь при постоянном неремешивании. Растворитель упаривают при пониженном давлении и твердый остаток растирают в порошокс водой. Получившиееся порошкообразное вещество отделяют фильтрованием и пересаждаютиз смеси ДМФ/этилапетат. Выход продукта 0,88 г (62% от теоретического); т.пл. 174-177; А -15,0 о(с = 1,0%; ДМФ).Найдено,%: С 57,54; Н 6,18; Й 16,21 3544 4 .О й да 0Вычислено,%: С 57,79; Н 6,01; Й 16,123. Получение ь - АРа - Агц- Ре-РЪе -Тзг- Нн20740 мг Е--Ис- Ащ(.ИО )0 йч-РЪеРЪе-Тчт-НН растворяют в 30 мл уксуснойкислоты и в течение 7 ч проводят каталитическое восстановление над палладием.Затем катализатор отфильтровьимют и расъ-,воритель упарнвают прн пониженном давле%нии, Остаток наносят на колонку (1,6 х 15 см),заполненную карбоксиметижефадексом, ипроводят хроматографию, используя линеВно.градиентную элюпию водными расчээрами апетата аммония: 0,005 н 1,0 н. (нэ700 мл каждого расчэора). Фракиюв эт580 до 790 мл эбьединяют и лиофащжруют. Выход продукта 540 мг (75% оттеоретического); 4 20,0 э (с 0,5%;вода.Найдено,%: С 54,20; Н 6,50; 814,99ав оотф 1 о аа аОВычислено,%; С 54,06; Н 6,91; И 15,01,Аминэкислэтный анализ: АР 0,95 (1); фИМ 1,05 (1); Т 1,00 (1); РЬЬ 2,ОО .-СВм- РЪе -РЬе-Тз 3 - КН (9,33 г)растворяют в 20 мл воды и к нему добавляют 2,2 г моногидрата лимонной кислотыпри перемешивании, Образовавшийся кристаллический осадок отделяют фильтрэванаем н фпромывают небэлыпим количеством холодной воды. Получают 10,4 г соответствующего диинтрата; а 3 -19,6 (с = 1,0;вода),Найдено,%: С 52,28; Н 5,87, Й 12,46С Н Ом 2 сн 0Вычислено,4 С 52,54; Н 5,82; Н 12,25П р и м е р 42. Получение у-АЬо-Аг- Сйч - Рпе-РИе-тчр- ин60 50А, Получение Х - у - Л Ьо - АгД(М Оа)"-Яу-ОИ,К 4,38 г Е-Дг.(МО 1-СЧ-ОЕФ,добавляют 40 мл 25%-ного раствора НВ)фв уксусной кислоте и после встряхиваниясмеси при комнатной температуре в течение 30 мин добавляют диэтиловый эфирВыпадавший осадок отфильтровывают н сушат над гидроокисью натрия.Затем его растворяют в 30 мл ДМФ ипосле охлаждения на бане со льдом раствор нейтрализуют тризтиламином. К раствору добавляют 4,16 г Е ДЬц- ОМВи смесь оставляют на ночь при постоянномперемешиванин. Растворитель упаривают припониженном давлении н к остатку добавляютводу, которую затем отделяют декантапией.К остатку добавшпот диэтнловый эфир, выпавший в осадок продукт отфильтровываюти переосаждают нз апечонитрила, Выходпродукта 2,5 г (48% от теоретического),т.л . 60-62 С; д.3 -11,1 о (с = 1,0%;Пиф).Найденэ,% С 50 12аа 33 8 тВычислено,%: С 50,47; Н 6,35; Н 18,73Б. Получение Х- )"- ДЬо- Дг( (ИО 1-еч- он.2,0 г - у - ДЬц - Дгд (МО )- ЦВОЕ 1растворяют в 20 мл ацетона, и охлаждаяна бане со льдом, добавляют 5,7 мл 1 н.водного раствора гидроокисн натрия. Смесьыремешивают в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем добавляют 6 мл1 и. соляной кислоты и упарнвают апетонпри пониженном давлении, Выпадавшие кристаллы отфильтровывают и перекристаллизовывают из смеси этанол/вода, Выход продукта 1,86 г (98% от теоретического); т.пл.113-115"С; 143 -20,0 о (с1,1%;ДМФ),В. Получение 2- у- ДЬо-Аг(й 0 а 1-йЬ-Уйе-РЪе-тг- кнК 1,34 г Е-Рпе-РЪе-Тг-МНдобавляют небольшое количество анизолаи после этого 13 мл 25%-ного раствораНВИ в уксусной кислоте.После встряхивания смеси в течение45 мин при комнатной температуре к нейдобавляют диэтиловый эфир и выпадаюшийосадок отделяют фильтрованием и высушивают над гидроокисью натрия. Параллельно сэтим 0,99 г Х-у. ДЪц-Агу(МОа)-Й 8 ч= ОН и 0,43 г НОЙВ растворяют в 5 млДМФ и, охлаждая смесь, на бане со льдом,добавляют 0,50 г ДЦГКДИ. Смесь перемешивают в течение 6 ч и отфильтровываютвыпавшую в осадок ДЦГМ, Полученный поописанной методике аминокомпонентН-РЪе-Рпе-Тчг-ИН )растворяют в 10 мл ДМФ ий577975 К этому раствору добавляют полученныйраствор активированного эфира и смесь оставляют на ночь при постоянном перемешивании, Растворитель упаривают при пониженном давлении и к остатку добавляют воду,выпавший осадок отфильтровывают, промывают этилацетатом и переэсаждают из смесиДМФ,этилацетат. Выход продукта 1,01 г-12,9 о (с = 1,1%; ДМФ).Найдено,%: С 59,63, Н 6,43; И 15,03у ьт 1 з)11гоВычислено,%: С 59,50; Н 6,32; 11 15,58Г, Получение б- Ассар- Ать"- Ц-РЪеИе - т 1 г - м н215700 мг Х - Е- Д. Р - Аг( М О,) - бЕ-РЬе -7 Ье - Т) - 11 Н г РаствоРЯютв 40 мл уксусной кислоты и в течение14 ч проводят каталитическэе восстановление, используя палладий в качестве катапизатэра. Катализатор отфильтровывают,растворитель отгэнчют при пониженном давлении. Остаток вносят в колонку ( 1,8 х 1 2 см),запэлненную карбоксиметилсефадексэм ихроматографируют, используя линейно-гра 25диентную элюцию вэдяными растворамиацетата аммэния: 0,1 и 1,0 н. (пэ 700 млкаждого раствора). Фракции эт 430 до550 мл объединяют и лиэфилизируют. Выход продукта 430 мг (62% от теоретического); с(. -13,2 (с = 0,5%; вода).Найдено, й: С 55,48; Н 7,39; М 14,47Вычислено,%: С 55,43( Н 7,24; Н 14,37 35Аминокислотный анализ; А)р 1,00 (1)",б 1 З 1,00 (1); Ьчь 0,94 (1); Туг1,00 (1); 1"11 е 2,07 (2).; содержание пептида 84%,П р и м е р 44. Получение Ьчэ-.АГ-Й- ОЕ 1Целевой продукт получают по методикеприлэра 43 А, используя 2,07 г ди- Е - 45- ч -ОН в виде геля, который переосаждают из смеси вода/этанол/этилацетатВыход продукта 2,57 г (73% от теоретического) т.пл. 161-162 С; 1 д ) -11,9 э-1 з - О Е 1 в 10 мл ацетата эхлеждают на бане со льдом и добавляют 2,1 мл2 н. водного раствора гидроокиси натрия,54Смесь перемешивают при кэмпатнэй температуре в течение 2 ч. Зятем добавляктт1,4 мл 1 н. соляной кислоты и отгоняютацетон при пониженном давлении. статокразбавляют 10 мл воды и этфнльтровывакттнераствэривтцийся осадэк. Раствор подкисляют 1 н. соляной кислотой и выпавшийстуденистый осадок отделяют фильтрованием, Выход продукта 1,78 г (93% эт т)- г- 56- Рпе - РИе -Тзг - МНгИспользуя 1,21 г ди- Х- Ьчь - А).,э (л 11 ).- С - ОН вэспрэизводят методику ц 1 нлс -ра 43 В. Получают 1,21 г 58% эт тгретического) сэедин 4 ения в виде гни; т.пл,199 203 эС; 1.Ы. -13,3 э (с = 1ДМФ).Найдено,%: С 58,70; Н 6,26; г 114,7;.Вычисленэ,%: С 58,75; Н 6,2;); 11 14, 1Г. Получение 1. ( - А) э.- 36 - Р 1)е - Р 11 е-Тм- 1 Ч НВ 30 мл уксусной кислэт 1. Раствэряют1,00 г ди--- А) г(НО,) - ЦЬ- РЪЕРЪе - Тг - 11 Н и в присутствии пяллагциевэй черни как катализатора проводят втечение 20 ч каталитиче:кэе восстановление. Катализатор отфильтровывают и растворитель отгоняют при пониженном давлении. Остаток хроматографируют на колонке.")люцию осушествляют методом линейногоградиента, используя водные растворы ацетата аммония от 0,1 (500 мл) до 1 н.(1)РЪЕ 2,06 (2); содержание пептида82%П р и м е р 45. Получение А,-ВОЬ-Агду - РИе-РЪе-Тг- МНгА, Синтез ди- Е - с(,-2 оЬ- А) (80 )-С,Е-ОЕ,В 40 мл диэтилэвэго эфира суспендируют 2,84 г дп- Е - ,-с Ь -11 Д 1 11 А(ДЦГА - дициклэгексиламин) и полученную суспензию встряхивают с ),5 н.р 57797525 ной кислотой.;эфирный слой этделвот, промывают водой и сушат над безводным сульфатом натрия, Растворятепь отгоняют в вакууме и дальнейшие манипуляции с остатком производят в точном соответствии с методикой примера 43 А, В результате получают соединение в виде геля. Продукт переосаждают из смеси вода/этанолlэтилацетат. Выход продукта 2,36 г (70% от24 теоретического); т.пд, 153-156 ОГ; д-9,4 о (с = 1,0%; ДМФ).Найдено,%; С 53,26; Н 5,84; 816,24 Вычислено,%: С 53,56; Н 5,99; М 16,66.Б, Синтез ди- Х- А,"- ЭоЪ- Ау(МО )- -ЕУ-ОН.В 10 мл ацетона растворяют 2,0 г ди- Е - а(., - ЭМЪ - Аг(МО) и к подученному раствору при охлаждении на ледяной бане прикапывают 2,97 мл 2 н, водного раствора гидроокиси натрия, Смесь перемешивают в указанных условиях в течение 1 ч, после чего прибавляют 3 мл 1 н, соляной кислоты, Ацетон Отгоняют при пониженном давлении и к. оставшемуся раствору прибавляют 10 мл воды, Нерастворившиеся примеси отфильтровывают и фипьтрат подкисляют соляной кислотой. Образовавшийся при этом желатиноподобный осадок отделяют от маточной жидкости фильт 30 рованием. Выход продукта 1,67 г (90% от теоретического), т.пл. продукта 112- 113 ОС; Ы.3, 8,3 О (с = 1,1%; ДМФ).Найдено,%: С 50,53; Н 5,59; М 17,19Н О МН 028 36 1 э 8Вычислено,%: С 50,55; Н 5,76; М 16,89 В. Получение ди- д., т - ЭОЪ - АгД (ИО,)- Ц 8 У - Р 1 е- РЪе - ТУг-ИН,.Используя 1,12 г ди- Е - Ф, у - 2 дЪ - 40 -Агд(ЙО )- 50 ОН, воспроизводят методику примера 43 В. В результате получают 1,02 г ( 51% от теоретического) соединения в виде геля, т.пл. 191-195 ОС,д-14,0 О ( = 0,9%; ДМФ). 4Найдено,%; С 59,13; Н 6,14; Н 15,46Вычислено,%: С 59,02; Н 5,95; И 15,02Г. Получение А,у- ЗдЬ - Агд-У- Рйе 50 -рЪе-ТУг- ВН2В 30 мд уксусной кислоты растворяют600 мг ди- -д., у -ВсЪ-Аг(ИО )- - С,Ву- РИе -ТЪе - Туг - Ин и, .используя папладиевую чернь в качестве катали затора, проводят в течение 12 ч катапитическое восстановление. Катализатор отфильтровывают и растворптель упаривают при пониженном давлении. Остаток хром;атрографируют и колонке (3.,8 х 10 см) с кар-щ боксиметипсефадексэм. Элюцию осуществляют методом линейного градиента От 0,1 н.водного раствора ацетата аммония ( 500 мл)к 1 н. водному раствору ацетата аммэния-17,9 (с = 0,6%; вода),Найдено,%: С 52,12; Н 6,99; М 15,3139 %3 7 4 2 4 2 2Вычислено,%: С 51,96; Н 7,08; Н 14,82Аминэкислэтный анализ: Аг 1,00 (1) ,ВЬ 1,04 (1); (;Еу 1,09 (1) ТУг1,02 (1)," РИе 2,13 (2) , содержание пептида 79%. Формула изобретения Способ получения пэпипептидов эбшсйфэрм удыЯ - Ьго - Й - РЬе - РЬе - М2где Й - атом водорода или остаток эснэвнэй или нейтральной аминокислоты,Р - нейтральный аминокислэтный остаток,Р - Мн, ТУг - мн, остаток тирозипь 3. 2.1ного пептида, содержащего в своем составеот 1 до 5 аминокислотных остатков, илиостаток амида тирозильного пептида, приусловии, что, когда Й- атом водэрэда,й соответствует Ргоо т л и ч а ю щ и й с я тем, что аминокислоту, сэответствующую Р 4 или аргинин, в том числе, когда К 4 представляетсобой атом водорода или пептидный фрагмент полипептида указанной фэрмулы, содержащий аминокислотный Остаток Й 4 илиаргинильную группу в том случае, когдаР представляет собой атом водорода, вкачестве И -концевой аминокислоты, конденсируют с недостающим фрагментом полипептида, причем каждое нз исходных соединений может быть защищено по своимамино- и карбоксильным группам, которыене должны принимать участие в конденсации, и может быть активировано по темамино- иди карбоксильным группам, которые непосредственно участвуют в указанной реакции конденсации, с последующимудалением защитных групп из полученногополипептидногэ продукта,Приоритет по признакам:26,03,74 при,й - остаток Основнойаминокислоты или остаток нейтральной аминокислоты отличной от Й -аминокислоты,Й Глицин Я)Й 2 ТУг МН 24.01,75 при й - основной или ней(тральный аминэкислэтный остаток,Й - нейтральный вминэкислэтный .саатэк, 577975 РВН, Т - МН, остаток тирозиль ного лятипа, солеуикащс.го в своем составе от . л о 5 амин окисл отных ос татк ов или его амид, при условии, что, когда К, представ 58ляет собой ЗР,У и Я предгтлвляет собой КН или Тм -МН, Я о.полает д -аминокислотный остаток; колла Кпредставляет собой прэлин, И - атом пю роллСоставитель В. ВолковаРедактор Н, йжарагетти Техред Н, Андрейчук Корректор А. Ж алтаниЗакаэ 3247/53 Тираж 553 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент, г, Ужгород, ул. Проктная, 4пы Й, могут существовать в виде оптических изомеров, зти аминокислоты могут иметь любую оптическую конфигурепию (могут быть пэбым оптическим изомерэм) или представлять собой рацемическэе соединение,Реакцию конденсации можно проводить, используя приемы и методы конденсации, известные для образования пептидной связи.Перед проведением реакции конденсации можно защитить карбоксильные и аминные группы, которые не должны принимать участия в рассматриваемой реахции, или, наоборот, активирэвать карбоксильную и/или аминную группы, которые должны участвокть в этой реакции. Все операции по защите или ц активации функциональных групп реагирующих веществ осуществляются известными методами. Карбэкисльные группы в исходных веществах, которые не должны вовлекаться в реакцию конденсации, могут бьггь защищены солеобразованием, т,е. переводом в соответствующие металлические сопи (например, натровые или калиевые соли) или этерификацией, что связано с получением соответствующих сложных эфиров (напри- я 5 мер, метилового, этилового, бензилового Й -нитробензилового, трет,-бутилового или трет,-амилового) .В качестве защитных группировок для аминогрупп исходных соединений могут быть 30 использованы любые известные защитные группировки, которые применяются в пептидном синтезе, например бензилоксикарбонильная, трет 4 утилоксикарбонильная, трет-амилоксикербоййльйая, язэборнилоксихар бонильная и другие группы. Эти защитные группировки могут использоваться длязащиты иминогруппь нрэлина. Имидезольная функция гистндина может быть защищена с помощью любой применяемой для этой цели 40 защитной группы, например бензильной, тозильной, 2,4-динитрофенольнэй, трет.-бутилоксикарбонильной или бензилоксикарбонильной. Гидрэкснльные группы серина, треонина и тирозина могут быть защищены лю 5 эй обычно применяемой дня этой цели защитной группой, например бензильной, трет,- -бутильной или другой группой, способной образовывать простой эфир. Гуенидиновея группа аргинина может быть защищена та кими группами, как нитрэгруппа, тозильная, бензилохсихарбэнильная, изэбэрнилоксикарбэнильная или адаментилэксикарбэнильная, В качестве примеров ахтивирэванных карбохсильных групп в исходных соединениях мож-Ы нэ назвать сээтветствуюшие ангидриды, азиды, активирэвенные эфиры (например, пентехлэрфенилэвый, 2,4,5-трихлэрфенилэвый, 2,4-динитрэфениловый, ш,.э:.летнлэвый,-нитрэфенилэвый, М -эксису:иинимидный,60 М -окси-норборнен,3=.дикербоксимилный, И ьксифтелимидный или-оксибензэтриезэльный).Реакцию конденсации мэжиэ проводитьв присутствии растворителей, широко используемых в пептидном синтезе: безводный или водный диметилформамид, диметилсульфоксид, пиридин, хлороформ, диоксан,метиленхлэрид (дихлэрметен), тетрагидрофурен, а также различные смеси этих растворителей.Температуру для проведения реакции койденсации выбирают в пределах диапазона,относительно хоторогэ известно, что ояявляется приемлемым для проведения реахций, приводящих х эбрезэг-.нню чептидныхсвязей.После проведения реакции конденсациив том случае, кэгде пэлученный продуктсодержит защитные группировки, их удаляютобычными методами, применяемыми дляэтих целей, например, кателитнческим вос.становлением в присутстищ соответствующего хатализатэра, тахого, как павадиеваячернь, палледий не угле, платине ц т,д.;сольволизэм с использованием фтористоговодорода, трифторуксуснэй кислоты и тахдалее, а также вэсстенэвлением металлическим натрием в жидком жюшаке,П р и м е р 1. Получение Агу - агавРЬе - РЬе - Туг - И Й.А. Получение Е - Ад (ЙОя) - Ргб -- РМ - РЬе - Туг - г 1 Н.10,О г Я - РЬе - Рг е - Ту - МКрастворяют в 50 мл диметилформамида (уф)и восстанавливают над пелладиевой чернью.Через 10 ч катализатор отфильтровывают, фильтрат охлаждают в ледяной бане и к ох лажденнэму раствору прибавляют 7,37 г - - гЯ(ЙО) - Рго - ОН н 3,53 г НОЮ В ( И -охси-нэрбэрнен,3-дикар бохсамида), туда же прибавляют 4,06 г дициклогехсилкербэдиимиде (ДПГКДИ), и реакционную смесь перемешивают в течение 16 ч. Обр-зэвевшуюся дициклогекснлмочевину (ДЦГМ) отфильтровывают, фильтрат. упаривеют при пониженном давлении. К остат ку прибавляют 200 мл этилецетата н полученное при этом твердое порошкообразное вещество отделяют фильтрэванием. Осадок чистят перекристеллизацией из смеси ДМФ /метанол/вэде. Выход продукта 14,5 г (95,6",о от теэретическэгэ); т.пл, 100 103 С; 03 -29 7 (с = 0155% ДМФ).Найдено, %; С 59,51; Н 6,06; М 14,90,4 Ь 4 1 о 1 оВычислено, %: С 5 Э, (3; НЪ,10;Й 15,11Б. Получение Аг - Рго - РИ е - Рпе -- ТУг - ИШ 2100 мг К - Аг(ИОЯ - Рго - РЬе -- РИФ - Тг - ИН растворяют в 30 млуксусной кислоты, восстанавливают над палладиевой чернью, используемой в качествекатализатора гидрирования, в течение 20 ч,Катализатор отфильтровывают, фильтратупаривают досуха при пониженном давлении.Полученный остаток растворяют в 50 млводы, фильтруют, фильтрат сушат лиофилизацией. Лиофилизованный продукт растворяюти 5 мл воды и раствор вносят в колонну( 1,Й х 9 см), заполненную карбоксиметилсефадексом, проводят градиентную элюпию0,1 М водным раствором ацетата аммония(400 мл) и 1 М водным раствором ацетата аммония (400 мл). Фракции от 250 до370 мл, объединяют и пиофилизуют, Получают 250 мг (52,3% от теоретического)белого пушистого продукта; Й 3-41,9 о(с " 0,47%, вода),Аминокислотный анализ продукта (гидролиз проводят соляной кислотой в стандартных условиях): Агэ 1,00; Р о 1,05;Ъг 0,91; РИе 1,96 (содержание пептидав продукте 86,5%).Найдено, %: С 56,76; Н 6,98; 814,28 Вычислено, %; С 57,06; Н 6,96;К 14,26П р и м е р 2. Получение О 1 у - Агав- Рго - РЬе - РЬе - Туг - ВНк.А. Получение 2 - 0(у - г Рго- Рпе - Ре - Гуг - Ии .80 мг Е - Аг(ИО) - .Рго - РЬе- РЬе - Туг - ЯН растворяют в 30 млуксусной кислоты и гидрируют над палладиевой чернью в течение 8 ч. Катализаторотфильтровывают, фильтрат упаривают досуха при пониженном давлении. Остатокрастворяют в 20 мл воды и лиофилизуют,Подученное в результате порошкообразное вещество растворяют в 10 мл ДМФ,к раствору прибавляют 147 мг моногидрата Н -голуолсульфокислоты. К полученной смеси прибавляют 349 мг Х- ч-ОМЬ,реакционную систему перемешивают в течение 10 ч. ДМФ отгоняют при пониженномдавлении, к остатку прибавляют 50 млэтилацетата. Полученное при этом порошкообразное вещество отделяют фильтрованием.Выход продукта 858 мг (89,5% от теоретического); т.пл, 119-121 оС с(,1 -26,7(с = 0,96%, ДМФ),Найдено, %; С 59,45; Н 6,08; И 1 2,37б 2,7648 18 9 10 7)8 ъ 2 йВычислено, %: С 59,55; Н 6,18, И 12,632,89Б. Получение С(у - Х 1 у - Р 1 о - Рпе -- РЬ - Туг - ЯНя,5 500 мг Я - С 1 у - Ащ - РРо - Рпе -- РМ - Туг - ЯН и -толуолсульфонатарастворяют в 30 мл уксусной кислоты, восстанавливают над палладиевой чернью в течение 5 ч. Катализатор отфильтровывают10 и фильтрат упаривают в вакууме, Остатокрастворяют в 20 мл воды, и полученныйраствор подвергают ионообменной хроматографии на колонке с Амберлитом 2 й А -41 Св ацетатной форме ( ДтЬегй 11 Е ЗЯА -410б представляет собой сильно основную анионообменную смолу) . Элюат лиофилизируюти полученное в результате порошкообразное вещество растворяют в 5 мл воды.Зтот раствор наносят на колонку (2,6 х 23 см)20 с карбоксим етилцеллюлозной, Злюцию осуществляют градиентным методом с использованием двух водных растворов ацетата аммония: 0,005 и 0,2 М (по 700 млкаждого полученного в примере А раствора)2 с нарастанием концентрации этпоента. Фракции в диапазоне от 840 до 970 мл объединяют и лиофилизируют. В результате получают 270 мг (63,6% от теоретического)целевого продукта; А 11 -62,0 о (с =0,46%,30 вода) .Найдено, %: С 55,99;Н 6,92; г(14,77Вычислено, %: С 56,15; Н 6,82;И 14,89Аминокислотный анализ; АгГ 0,94; рго1,06; Ич 1,00; Тчг 0,94, РЬе 2,03-Ыч-ОКВ-у-Ми-ОкаВ результате получают 324 мг указанного45 соединения; сЦ -58,7 о (с = 0,45%,вода),Найдено, %: 56,14; Н 7,36,И 13,92СНО Н о 2 С Н 0 3 НОВычислено, %:С 55,97; Н 7,15;50й 14,19Аминокислотный анализ; Аг 1,00; Рго1,08; Тч 1 0,97; РМ 2,13 (содержаниепептида 80,8%).П р и м е р 4. Получение Е - Асвр -55- А га - Р 1 о - Р Ь е - Рп е - Туг - ВИА. Получение Я - : - Асар - Аг -- Рго - Р 6 е - РЬ е - Туг - й Н ,В 10 мл ДМФ растворяют 250 мг69 Е - 6 -Асар-ОН и к полученному растворупри охлаждении на ледяной бане прибавляют186 мг НОНВ и 214 мг ДЦГКДИ.Смесь перемешивают в течение 16 ч,образовавшуюся ДЦГМ отфильтровывают.Фильтрат прибавляют к диметилформамидному раствору Н - А 1- Рго - РЬЕ -- Р е - Туг - Нйя и -толуолсульфэната,который получен по методике, описанной впримере 2 А. Смесь перемешивают в течение 12 ч, ДМФ отгоняют при пониженномдавлении. К остатку прибавляют 30 млэтилацетата и образовавшееся при этомпорошкообразное вещество отфильтровывают. Выход продукта 810 мт (79,1% оттеоретического); т,пл. 90-92 эС; А 3-30,3 э (с = 1,07% ДМФ).Найдено, %: С 59,81; Н 6,75; 811,80;5 3,0052 66 О 1 О 1 9Вычислено, %: С 59,88 Н 6,65;А/11,84; 5 2,80Б. Получение Я - Ассар - Дг - Р о -- Рпе - РИе - ТУг -НН 2.500 мг К -производного, полученногов примере А, обрабатывают пэ примеру 2 Б,в результате чего получают 316 мг указанного соединения. с 3 58,9 С ( с =23 э= 0,55%, вода) .Аминокислотный анализ; Агу 1,02; Рто1,03; Т 1 0,92; РЬе 2,13; Е -Асарне определяли; (содержание пептидов 81,5%).П р и м е р 5. Получение 1.ук - Аг -- Рго - РЬ е - РЬе - Туг - ИН .А, Получение ди- Е - Ьуз - Агй - Рго -- РЬе - РЬ е - Гуг - ЮгПроцедуру из примера 4 А повторяют стем исключением, чтэ вместо Х - Я -(содержание пептида 91%),П р и м е р 6, Пэлученне с 4,р - Раб 1 г - Рго - РЬе - РЬе. - .Туг1 ЧНг Аналогично прилжрял 1 4 н 5, нэ исходяиз 535 мг ди- й - д. - у - ЭО 1 Ь -липцкл 1 гексиламмэнийнэР соли, синтезирован указанно соединение с выходом 325 мг,"Ю -58,2 С ( с=0,50%, вола).г ГАминокислэтный яналиэ: А, у - ЭсмЪ1,00, Д0,98; Р 1,00; т.Рй 1,96 (содержание пептида 84,2%),П р и м е р 7. Получение р(ц(о - Аг - Рго - РЬ е - РЬ е - Туг - М(.А, Получение К - б - АЬх - - Лгу (МО )"г"- Рго - ОМ е,К 3,50 г Е - АгдЯОя) - Р 1 о - ОМеприбавляют 35 мл 25%-пэго раствора15 НВ 1 в ледяной уксусной кислоте, Реакционную смесь встряхивают при комнатнойтемпературе в течение 35 мин, К этойсмеси прибавляют 300 мл диэтилэвэгэ эфира, образовавшийся при этом осадок эт 20 фильтровывают, промывают эфиром и сушат.Полученный порошок растворяют в 20 млДМФ и при охлаждении ня ледяной баненейтрализуют раствором триэтилямпня, Затем прибавляют 2,9 г 1- Ъ А 1 О - ОМВ иЖ перемешивают в течение 16 ч. ДМФ отгэняют при пониженном давлении, остатокрастворяют в 300 мл этилацетата. Полученный раствор трижды промывают 4%-нымводным раствором бикарбэната натрия (порЗО ции по 100 мл). После промывки вэдэйраствор сушат над безводным счльфятэмнатрия. Растворитель отгоняют при пониженном давлении и к остатку добавляютэтиловый эфир. Полученное при этом парэшЗ кообразное вещество отделяют эт маточногораствора фильтрованием. Выход продукта3,05 г (74,3% от теоретического), т.пл,62 65 эС (ц34 1 а (с - 1 04% ДМФ)Найдено, %: С 50,98; И 6,36; К 17,72Вычислено, %: С 50,73; Н 6,2,й 18,01Б, Пэлученне Е - б-АЬ - Аг(ЯОк) - Ргд - ОНВ 30 мл ацетона растворяют 2,82 гЕ - 5 - Ма-АгдЯой) - ,Рго - ОМе, кполученному раствору, охлажденному на ледяной бане, грибявляют 10,7 мл 1 н. водного раствора гидроэкиси натрия. РеакциО онную смесь перемешивают при комнатнойтемпературе в течение 2 ч, Затем смесьнейтрализуют 11 мл 1 н. соляной кислоты,раствор упаривают при пониженнолт давлении,К полученному млслянистэл(у остаткуприбавляют 30 мл холодной вады и водныйслой отделяют декаггацией. Остаток промывают адин раз холодной водой и сушат,после чего этот продукт хрэматаграфруюяфо на колонке с силикагелем (90), 1 .п,п-7 г-ИН и, используя в качестве катя;п 1 затэ 13П р и м е р 8. Получение,4 - Агав- АгУ - Рго - РЬе РЬе - ИН 2Аналогично примеру 7, но с заменой7 - РЬе - Р 1 Е - . ТУг - МН 2наХ - Рпе Рпе -- ЯН 2 получают 1,24 гуказанного сэединения в виде белого пушистого продукта; Щ -48,6 о (с = 0,42%;вода) .Аминэкислэтный анализ: АгД 1,08; РЙц1,00; рпе 1,98; -АГс 0,97 (содержание пелтида 82,6%).П р и м е р 9, Получение- А(а -- АгР - 6 - А 1 а - РЬе - РЬе - Тг - Я Н 2,А. Получение Р - ,6 - Л 1 а - РЬе. -- Рпе - Туг - ЯН .152,00 г Е - Ре - РЬе - ТУг - ВН 2растворяют в 40 мл ДМФ и гидрируют надпалладиевэй чернью в течение 5 ч. Катализатор отфильтровывают я к фильтрату прибавляют 1,39 г 2.- -А 1 с-ОМВ . Реак- Оционную смесь перемешивают в течение 9 чи ДМФ отгоняют при пониженном давлении.К остатку прибавляют 50 мл воды, получившийся при этом порошок отделяют фильтрованием и сушат. Полученный продукт .чистят перекристаллиэацией из смеси ДМФ//зтилапетат. Выход продукта 2,02 г (88,0%от теоретического), т.пл. 232 оС;Щ 23 4 о (с = 0,94%; ДМФ).Найдено,%: С 65,18; Н 6,20; И 10,32Вычислено,%; С 65,41; Н 6,21, И 10,04Б. Получение Е - Аг (МОя) - ,4 ФаРЬЕ - РЬЕ - Тг - Ий235В 30 мл ДМФ растворяют 1,0 г У - 6 -- А(а -РИе - РЬе -Туг -ИН и, используяпалладиевую чернь в качестве катализатора,гидрируют в течение 6 ч. Катализатор отфильтровывают и к фильтрату прибавляютраствор 2-Агр (НО )-ОВИРгидрофуране ( указанный динитрофениловь йэфир получен иэ 0,52 г 7- Агд(ИО )" ОЙи 0,30 г 2,4-динитрофенола в 10 мл тетрагидрофурана дициклогексилкарбодиимидным45методом), Реакционную смесь перемешивают втечение 13 чрастворитель отгоняютв вакууме, К остатку прибавляют 50 млводы, полученное порошкообразное веществоотфильтровывают и сушат. Выход продукта;1,01 г (74,9% эт теоретического); тпл,50192-194 оС 41 -11 1 о (с = 1,02%Дмф),Найдено,%: С 57,63, Н 5,93; . Й 15,61Вычислено,%: С 5 7,63; Н 6, 1 6;) 15,28 С, Получение Х - б - А 1 о - Аг (И 02) -- ,6 - А 1 а - Рпе - РЬе - ТЧгМН 2.60 К 700 г Е Р А( Аг ( ) - Иа - Рбе - РЬе - Туг (Я 2 прибявпяют 0,2 мл анизэла и вснк д эя зткм 7 мл 25% НВ 1 в ледяной уксускэй кислоте, Смесь встряхивают при кэмкяткэй температуре в течение 40 мик, после чссэ к ней прибавляют 100 мл зтилэвэгэ эфира, выпавший при зтэм осадок отфильтровывают и промывают ня фильтре зтилэвым эфиром. Осадок тщательно высушквщот рястворяют в 10 мл ДМФ и нрн охлаждении льдом нейтрализуют ряствэр три; типаюном, Вслед за этим в реакционную скст;.ну вводят 336 мг Х-ъ-АГс- ОМ 6 к Раствор перемешивают в течение 18 ч. В п 1 чьней шем отгоняют ДМФ при пэкнкеннэм давлении и к остатку после упярнвякпя реакционного раствора прибавляют 50 мл воды. Образовавшийся при зтэм эсядэк отделяют фильтрованием, сушят к пересажпят кэ ДМФ и этилацетвта, Выход продукта 560 мг (73% от теоретическэго); т.пл.200-202 эС (разложение); сК 12 -7.3 э (с = 0,91%; ДМФ) .Найдено,%: С 58,06; Н 6,4); М 15,57Вычислено,%: С 58,19; Н 6,13;М 15,89Д, Получение,В А(а - Лгц - д - А 1 а - Рпе - Рбе - Туг - ИН 2В 30 мл ледяной уксусной кислоты растворяют 400 мг эащпценнэгэ пептнда - ,а - А(а - АГд Ю 2) - 8 - ЯаРЬе - РЕ -ра палладиевую чернь, гидрируют в течение 8 ч. Катализатор удаляют фильтрованием, раствэритель отгоняют при пэкиженном давлении, Остаток растворяют а 5 мли полученный раствор наносят ня кэлэкку(2, 6 х 22 см)с карбоксиметнлцеллюлэээй,Градиентную элюцию проводят с испэльзэванием 0,005 и 0,2 М водных растворовацетата аммония (пэ 700 мл каждогэраствора). Фракции элюата эт 720 до870 мл объединяют и. лиэфилиэуюг, Получают 270 мг (69,1% от теоретического),белого пушистого продукта; (с.1, -17,2Е 2577975 45 15получают 297 мг указанного соединения ввиде белого пушистого порошка," А.- -18,9(содержание пептида 81,0%),П р и м е р 11. Получение .ф - Иа -- Ь- Фаг - РЬе -РЬе - ЧЪг - МН 2,А. Получение Е - Ьаг - РЬе - РЬ е -- юг - МБу. 10В ЗО мл ДМФ растворяют 2;02 г 2"РМ"Р)16-Тъг-ИИ и, используи в качестве катализатора нещадиевую чернь, гидрируют в течение 5 ч, Катализатор отфильтровывают и фильтрат охлаждают. От- (йдельно растворяют 810 мг -бог-ОИ в10 мл теграгидрофурана и к раствору добавляют 0,71 г НОИЪ. Смесь охлаждаютдо ОоС и прибавляют к ней 0,82 гДЦГКДИ,Полученную реаеяиоииую смесь перемешива- оют в течение 3 ч. Образовавшуюся ДОГМотфильтровывают, фильтрат прибавляют кохлажденному диметилформамидному раствору. Смесь перемешивают в течение 20 ч,после чего растворитель отгоняют при пониженном давлении и к остатку прибавляют50 мл воды. Полученное при этом порошкообразное вещество отделяют фильтрованиеми переосаждают из смеси ДМФ/этишщетат.Выход продукта 1,90 г (83,8% от теоретического), т.пл, 246-248 оС (разложение),А-9,7 о (с = 1,07%; ДМФ),1 Райдено,%: С 66,32; Н 6,39; И 10,52Ьен 10755 Ц 2 НгоВычислено,%; С 66,26; Н 6,15; Й 10,17Б, Получение " - Агу (ИОя) - ц -- РЬе - РЬе - Тг - ИК .2В 10 мл ДМФ растворяют 1,0 г 7 - Ьог- РИе - РЛе - Туг ЯН и, используя вкачестве катализатора палладиевую чернь,40гидрируют в течение 7 ч, Катализатор отфильтровывают и фильтрат охлаждают, Перед этим в отдельной реакпионной системерастворяют 0,52 г Е-Аг(т(МО )-ОН в10 мл тетрагидрофурана и при охлаждениильдом прибавляют к раствору 0,3 г 2,4-динитрофенола и 0,33 г ДЦГКДИ, Реакционную смесь перемешивают в течение 3 ч,образовавшийся осадок ДЦГМ отфильтровывают и фильтрат прибавляют к диметилфор 50мамидному раствору, Смесь перемешиваютв,течение 20 ч и упаривают при пониженном давлении. К остатку прибавляют 50 млводы и образовавшийся при этом осадок от 55фильтровывают. После высушивания полученное порошкообразное вещество переосаждают из смеси ДМФ/этилацетат/этиловыйэфир. Выход продукта 1,04 г (77,2% оттеоретического) , т.пл. 96-98 оС; А7,3 о (с = 1,06% ДМФ). 16Найдено,%; С 57,60; Н 6,10; 815,01Вычислена,%; С 57,63, Н 6,16 815,26С. Получение 2 - В - А(а - Агс (МОк) -- За г - РЛе - РЬ е - Туг - МНй.В 7 мл 25%-ного НЬ в ледяной уксусной кислоте растворяют 700 мг Я --ЬГЯ(Щ-ЪМ - Рйе-гле-Тг ЙН и 0,2 мланнзола и раствор встряхивают при комнатной температуре в течение 40 мин. К реакционной смеси прибавляют 100 мл этилового эфира, и полученный осадок отфильтровывают, промывают на фильтре эфироми сушат над гранулированной гидроокнсьюнатрия в течение 2 ч,Высушенный осадок растворяют в 10 млДМФ, раствор охлаждают на ледяной банеи нейтрализуют триэтиламином. Затем прибавляют 336 мг 1-Ъ - АСс-ОМ 3 и раствор перемешивают в течение 20 ч. Послеэтого растворитель (ДМФ) отгоняют припониженном давлении и к остатку прибавляют 50 мл воды. Полученный при этомпорошкообразный осадок отфильтровываюти после высушивания переосаждают из смеси ДМФ/этилацетат. Выход продукта 590 мг(76,5% от теоретического); т,пл, 135138 оС,А) -15,5 о (с = 0,99%; ДМФ),Найдено,; С 58,18, Н 6,40; Я 15,60Ф 7 П 11 11, 2Вычислено,%: С 58,19; Н 6,13; 815,89Д, Получение В - А(а - Агу - Ьаг ---- Туг - ИН .В 30 мл уксусной кислоты растворяют450 мг защищенного пептидного производного я - В - А(а - Ал д - Заг - РЛе - РЬе - Туг - МНн в присутствии палладиевой черни гидрируют в течение 8 ч, Катализатор отфильтровывают и фильтрат концентрируют ввакууме досуха. Остаток растворяют в 5 млводы и хроматографируют на колонке (2,6 хх 22 см), заполненной карбоксиметилцеллюлозой. Градиентную элюцию проводят сиспользованием 0,005 и 0,2 Х водных растворов ацетата аммония (700 мл каждогораствора), причем целевое соединение выходило из колонки во фракциях от 770 до880 мл. Эти фракции объединяют и лиофилизуют, Получено 309 мг (70,4% оттеоретического) белого пушистого продукта,Ь 1 -21,5 о (с = 0,46%; вода).Найдено,%: С 54,99; Н 6,76; И 14,58Вычислено,%: С 54,53; Н 7,03; И 14,79 Аминокислотный анализ: АРр 1,00; Гчп0,88, РИЫ 2,02; Ь-,АГО 0,98, 5 йг неопределялся (содержание пептида 78,7%),П р и м е р 12, Получение (,ец - Аг -- Ро - Рбе - РЬе - ТгМНд,/ОИ 14,62 эО 17А. Пэлучение Е - 1.е -- мд(ИО) -- Рро - РЬ с - Ри е - Туг - НН.В 20 мл ДМФ растворяют 700 мг -РИе - РИе - 1 г - ХН, и гндрир;лот над палладиевэй чернью в течение 6 ч. Катали тор отфильтрэвявают и фильтрат эхла;кдаот, К этому фильтрату прибавляют 648 мг карбоксильного компонента Е-(,ео- Ьц(МО - =-г.о-ОН, а затем 247 мг НОЯ В и 285 э,.г ДЦГКДИ. Смесь неремеиваюв теченъ 20 ч, образовавшийся осадок диац(клэгек силмочевини отфильтроьываот и ЛАЙФ этРОняют при пониженном даяиении. , Зстат - ку прибавляют 50 мл воды и пэлученп-е порошкообразное вещество переносят на фильтр. Продукт супит и нереэсаждаот из смеси ДМФ/этиланетат/эфир,т.пл. 1 10111 С; а" -З 8,1 о (с = 1,0 Ъ; ДМФ), Вьход продукта 1,05 г (86,5% эт теоре.= тическ ого) .Найдено,%: С 59,24; Н 6,50;Вычислено,%:С 59,13; Н 6,59; 14,59Б. Получение )еи - Аго - Р; - р)е -Р, Т, мНВ 20 мл уксуснэй кислоты растворяют 5 мг защищеннэгэ пептидв Е - 1,ец - Йгякои- - Ро - Рйе - РЬе -- Т 3 - ИНк и вэттанавливают в нрисутствии палладнсвэй чер= ни в течение 10 ч. Катализатор отфильтрэвывают и филътрат кэнцентрнруот досуха при поникеннэм давлении. Остаток раствэ= ряют в 5 мл воды и хрэматэграф,пуат ж колонке (2,6 х 20 см)занэлненнэй карбэкгсилметилцеллюлэзэй, Градиентную элюни 5 нрэвэдят с использованием 0,005 и 0,2 А вэдных растворов ацетата аммэния (пэ700 мл каждого раствора). Целевой продукт выхэдит из колонки вэ фракциях от700 до 790 мл, Фракции объединяют и1 лиэфилизируют. В итоге получают 300 мг(содержание пептида 83,9%).П р н м е р 13. Получение,а - Ага -в Агц - РЬе - РЬе - РВе - Туг - ВНя.Л. Пэлучение Е - б - Иа - ХР (ИО) -- РЬЕ - РЬе - РЬ е - Тч (Ьп)-смолы.В реактор твердэфазнэгэ пептиднэгэ синтезатора загружают 4,33 г ВОС-ТУР(Ы 1)-смэлы (сэдержание тирэзина 2,18 ммэль),дают ей набухнуть и дихлэрметане, ввэдятв указаннэм пэрядке БОС- РЬ -ОН, ВОС- И Ре . ,1,". -;, - , - э- и Г, .1,.я,кдэ.п г л, - ,-, - .э-е зэ" с-.1 с. - си; - :.,ере Б:.; вэ:;. ав;:,-.ъ афд эт тф о ч эг-ЕЕ - Ье - -е - уг ,Ву - : у -.ссмэлы,В реактор тведэфэзп э- э и ептнд го сннмешают 4,0 г ВОС- Я. :".,;.ьсодер-. жаей 1,7 м. эль глпинна), дают ей набухн "в мет.гО.с пэр.сГн . - ,е.", 0ВОС. Рйе Н, БОС. Рг:- =ОН Г .С= . - -ОН, Аос - Аго (То) )Н и . - р-Ид-ОН, используя в качестве ,энденснртэ.егэ аген