Способ выделения кислой фосфатазы

(9) 0 2 и 9/16, С 1 г н 9/О о 3,."пцатю т. Дл БИаЛЙГ О ИЗО ЕН ЕЛЬСТВУ 270/30-13 1887,90, Бюл,оюзный науитут биоло В 25но-исслическо ователь- приборб.Евдок Соколо ов,Евсеев, В, ичкин, А.В ян15(088,8) М. еС а 1. С 11 п Сйетп1285-1289,нилсефарозы 4 В,слюлозы ДЕАЕ,разом кислая фос ои активност ммуносодерБО.с,СУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИ(56) 1,атп1979, 25,(54) СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ КИСЛОТНОЙ ФОФАТАЗЫ Изобретение относится к биохимии и медицине и касается выделения кислой фосфатазы и может быть использовано для создания иммунодиагностикумов,Целью изобретения является повышение удельной активности фермента,Способ заключается в следующем.Из эякулята получают спермоплазму путем центрифугирования эякулята, Затем кислую фосфатазу, содержащуюся в полученной спермоплазме, очищают хромотографией с последовательным использованием фенилсефарозы 4 В, сефадекса Си ДЕАЕ-целлюлозы, Центрифугирование позволяет отделить кислую фосфатазу от клеточного дебри-. са и сконцентрировать кислую фосфатазу в малом объеме. Предлагаем последовательность операций очистки с использованием указанных наполнителей позволяет наиболее полно провести очистку кислой фосфатазы от сопутст(57) Изобретение мии и,медицине, к кислой фосфатазы зовано для создан кумов. Целью изоб вьштение удельной Способ заключаетс эякулята получаютцентрифугированияфатазу, содержащу спермоплазме, очи с последовательнь относится к биохи-. асается выделения и может быть испольия иммунодиагностиретения является по- активности фермента. я в следующем. Из спермоплазму путемЗатем кислую фосюся в полученной щают хроматографией м использованием фефадекса Си целолученная таким обатаза обладает удель о 1200 ед/мг,вующих белковПолученная таким образом кислая фосфатаза обладает удель- "ной активностью до 1200 ед/мг,П р и м е р 1, Берут 150 мл эякулята, Удельная активность кислой фос- мфатазы в общем объеме исходного мате Яриала составляет 4,3 МЕ/мл. Затем Мэтот объем центрифугируют 15 мин при3000 8 для отделения спермоплазмы отклеточных элементов эякулята. Далее рспермоплазму, содержащуюся в надосадочной жидкости, хроматографируют вколонке с фенилсефарозой С 1,-4 В,проверяют на содержание КПФ в идиффузионном анализе. Фракции,жащие КПФ в области 0,2 М (ЯН )концентрируют ультрафильтрацией на156564 0,1 М раствором хлористого натрия.Эти фракции сливают вместе и проводятанализ. Концентрация белка в полученном материале 760 мкг/мл, а титр втест-системе на КПФ 1;800, Определяютконцентрацию КПФ с помощью радиоиммунного анализа на простатическую кислую Фосфатазу. КПФ составляет 760000.10 Полученная кислая Фосфатаза обладает высокой удельной активностью до1200 ед/мг,Формула изобретения15 Составитель В,Варламов Корректор А.Обручар Редактор Н,Рогулич Техред Л.Сердюкова Заказ 1830 Тираж 486 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 фильтре УИдо 90 мл, Чистота препарата составляет около 903,Полученный материал хроматографируют в колонке с сефадексом С 150 х 1100 мм, уравйовешенно ацетатнымбуФером 0,005 М, рН 5,0 с 0,1"М хлористого натрияСкорость элюции15 мл/ч, Фракции по 15 мл, Собранныефракции проверяют иа содержание КПФв иммунодиффузионном анализе. Этотматериал имеет концентрацию белка1,45 мг/мл, а концентрация КПФ составят 1,3 мг/мл.Таким образом, чистота препаратасоставляет около 907 При электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия выявляются несколько минорных компонентов (2-3), но иммунозация кроликовэтим материалом позволяет получатьхорошую моноспецифическую антисыворотку, Материалпосле гельфильтрациина сефадексе Сбуфера, рН 7,4,вводят в колонку с ДЕАЕ-целлюлозы, Скорость элюции 30 мл/ч, Фракциипо 10 мл. Элюции проводят ступенчатым градиентом возрастающих концентраций хлористого натрия в трис-НС 1буфере, рН 7,4, КПФ обнаружена вофракциях, элюированных с колонки Способ выделения кислой Фосфатазы, предусматривающий получение эякулята, экстракцию из него суммарной белковой Фракции и ее хромсграфическую очистку, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения удельной .активности Фермента, из эякулята перед его экстракцией выделяют спермоплазму центрифугированием, а хроматографическую очистку проводят последовательно на фенилсефарозе С 1,-4 В с злюцией снижающимся градиентом сульфата аммония от 1 до О, 1 М, на сефадексе Си на целлюлозе ДЕ- с элюцией возрастающим градиентом хлористого натрия от 0,05 до 1 М.