Штамм бактерий рrотеus vulgaris-продуцент рестриктазы р ii

) С 12 И 9/14, 1/20 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ 5/187 и ецифитехого л едова тель носСаССТСс бол нукл еотидов е высоким выхдом. ант при офил ьШтамм выделен к глубинном культиви ных микроорганизмоШтамм РгоСеця тщ теризуется следуюМорфологические к контам ан харак ками . приз призна измером 6 м ые или почти имеет ои размерам ентнын 1 иг грам ки. усваивает лоты и га к ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ХОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ (72) С.Х. Дегтярев, В.Е. Репин и Н.И, Речкунова(56) Авторское свидетельство СССР У 1552639, кл. С 12 И 1/14, 198 7. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ РКОТЕ 118 ЮЛ.САК 18 - ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ Р 70 11 (57) Изобретение относится к био нологии и касается получения нов Изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового штамма, продуцнрующего сайт-специфическую эндонуклеазу, слособную. узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 -САССТС, данный)сайт узнавания является единственным в ДНК плазмиды рВ Ки ряде челноч 322ных плазмид (41 р 5, 4 Кр 17, 4 Ер 2), что определяет возможность широкого использования этой рестриктазы.Цель изобретения - выявление штамма-продуцента РгоСеця сщ 1 яагя В(84), нетребовательного к питательным средам и синтезирующего одну сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять посштамма, продуцирующего саит-сческую эндонуклеазу рестрикции Ртщ 11, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5САССТС-З, Штамм Рго Тец я чц 1 даг 1 я (84) ВКПМ В- продуцент рестриктазы Рчц 11 вьделен как контаминант при глубинном культивировании гемофильных микроорганизмов. Штамм нетребователен к питательным средам, селективно продуцирует одну рестриктазу Рчц 11 с выходом 80000-100000 ед/г7 что в 2-2,5 раза превышает известный. Продолжительность культивирования в 1,5 раза меньше, чем в известном споетки палочковидные р км на 1,0-2,5 мкм, п прямые, в стационар ся вариабельность по разуют эндоспор. Бес трицательный. зиологические призна культативный анаэроб зу с образованием киза, выделяет Н Б, индолположитепьныйразжижает желатину, дезаминирует фенилаланин, каталазоположительный. Оттипового вида Ргогеця чц 1 яагхя отличается по способности сбраживатьманнозу и ксилозу,Культуральные признаки.Хорошо, растет на обычных комплексных питательных средах (СПА МПБ) 10при.температурах 30-37 С и рН 6,87;О. Колонии на агаризованных средахокруглые, сероватого оттенка, краяровные, При культивировании даетспецифический запах. 15Хранение штамма осуществляют подвазелиновым маслом, в растворе глицерина при -70 С или в лиофильновысушенном состоянии.Биотехнологические свойства штамма.При исследовании биомассы в нейобнаружена и выделена рестриктазаРчц 11, способная узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 255 -САССТС-З,Для глубинного культивирования используется доступная дешевая средана основе рыбного гидролизата, вместо пептоносолевой среды, Предлагаемый штамм характеризуется высоким выходом рестриктазы Рчц 11, составляющим 80-100 тыс.е,а,/г (в 2 раза больше, чем у известного штамма).П р и м е р 1. Клетки Ргогеця чц 1 вагя 84 бактериологической петлейпересевают на чашки Петри с агаризованной средой (на основе 3,5%-ногорыбного гидролизата), содержащей1% ную Донорскую кровь Чашки с за 40сеянной культурой инкубируют в термостате при 30 С 16 ч. Подросшую культуру переносят в жидкую питательнуюсреду следующего состава: рыбный гидролизат 3,5%, вода дистиллированная 45остальное, рН 7; 2. Культивированиеосуществляют в термостатированныхкачалках при 30 С; .200 об./мин, достационарной фазы роста,Глубинное культивирование проводят вферментере "МсгоГегш" в анаологичной среде при 30 С, аэрации 1объем в минуту, 200 об./мин мешалки.В течение культивирования следят заподдержанием рН и оптической плотностью, При достижении ранней стацио 55нарной фазы роста (оптическая плотность яво = 2,7) культивирование прекращают. Биомассу осаждают центрифугированием. Выход биомассы составляет 3,7 г/лЗамороженную или сырую биомассу Ргогеця чц 1 еагя 84 в количестве 10 г переносят в стакан вместимостью 50 мп, добавляют 30 мп буфера А, содержащего 0,02 М КНРО, 0,001 М ЭДТА; 0,01 М 2-меркаптоэтанол, рН 7,0. Содержимое стакана суспендируют на магнитной мешалке до получения однородной суспензии. Ее обрабатывают ультразвуком пять раз по 40 с (ультразвуковой дезинтегратор МЗЕ), мощность 200-300 Вт, частота 20 кГц, амплитуда 14 мкм) с охлаждением на ледяной бане, Клеточный дебрис отделяют центрифугированием, 1600 об./мин, 30 мин, центрифуга 1-21.ЗО мл осветленного лизата наносят на колонку с 100 смэ фосфоцеллюпозы Р. Сорбированный материал элюируют буфером Б (0,02 М КНРО, 0,01 М 2-меркаптоэтанол; 0,001 М ЭДТА; 1 М ЮаС 1, рН 7,0) до тех пор, пока поглощение элюата не станет равным поглощению буфером Б. Объем смыва 200 мл,Смыв переносят в диализные мешки . и диализуют против буфера А (3 л по 8 ч). Супернатант после диализа наносят на колонку с ДЕАЕ-целлюпозой объемом 8 см 3 со скоростью 20 мл/ч. Колонку промывают буфером А, Фермент элюируют линейным градиентом концентрации 0-1 М ИаС 1, объем градиента 100 мл. Элюат собирают фракциями по 5,0 мл. Фракции, содержащие фермент, объединяют и диализуют против буфера А (3 л) в течение 16 ч, нано.ьсят на колонку с фосфоцеллюлозой Робъемом 4,5 смэ . Фермент элюируют линейным градиентом 0-1 М ИаС 1. Объем градиента 50 мл. Элюат собирают по 1 мл фракциями, общий объем 10 мл. Полученный препарат диализуют в течение 16 ч против 400 мп буфера Б. Выход рестриктазы Рчц 11 составляет 100 тыс.е.а./г.П р и м е р 2. Культивирование биомассы и выделение фермента прово-: дили как и в примере 1 но использовали предварительный пассаж на агаризованной среде без добавления крови, Выход фермента составил 20 тыс,е.а./г,П р и м е р 3, Получение ферментапроводили как в примере 1, но припассировании штамма Ргогецяц 18 агдя84 Вна агаризованной среде приЗаказ 596 Тираж 366 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 меняли 0,5 Е-ную донорскую кровь, Вы-: ход фермента составил 80 тыс.е.а./г.П р и м е р 4. Пассирование проводили как в примере 1, но при концентрации крови 1,57. Наблюдали угнетение роста, выход биомассы составил 3 г/л. Выход рестриктазы 90 тыс.е.а./г,П р и м е р 5. Получение фермента проводили как в примере 2, но 10 использовали концентрацию рыбного гидролизата 4 Е. Выход фермента не изменялся, но наблюдается уменьшение урожая биомассы до 3,2 г/л. 74 6Полученный штамм обладает следующими преимуществами по сравнению с известным: содержит одну сайт-специфическую эндонуклеазу рестрикции Рчц 11, продуцирует в 2,5 раза больше целевого фермента, чем известный штамм, нетребователен к питательным средам, а также устойчив при хранении в различных условиях.Формула изобретенияШтамм бактерий Ргойепз ж 1 аагхз ВКПМ В- продуцент рестриктазы Рчи 11.