Способ получения пируватдекарбоксилазы из пивных дрожжей

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК 09) (11) 51)5 С 1 САНИЕ И ОБРЕТЕНИ К СКОМУ СВ 2зы, используемой в медицинской и сельскохозяйственной практике при ферментативном определении уровня тиаминдифосфата в крови или другой биологической жидкости. Цель изобретения - повышение стабильности препарата при хранении. Из отмытой биомассы готовят суспензию для экстрагирования белкового препарата, которую обрабатывают ультра звуком с частотой 20-22 кГц в течение 18-25 мин с последующим фракционированием ацетоном и сульфатом аммония, Заключительную очистку выполняют адсорбционной хроматогра фией на оксиапатите и ионообменной хроматографией на КМ-целлюлозе, Стабилизацию белкового препарата осуществляют внесением к гомогенной пируватдекарбоксилазе 2-3 М сульфата аммония и О, О 1 -О, 05 М сульфата магния в 0,02-0,1 М Ба-фосфатном буфере, рН 6,8 с лиофилизацией суспензии при -350 С, Лиофилизированный порошок хранят в плотно закрытых тюбиках при -15 С, Выход высоко- очищенной пируватдекарбоксилазы составляет 31 Х с удельной активностью 64,8 Е на 1 мг белка,2 табл,5/31-138890, Бюл. Рут биохимиирник ев ич, Э Н БССРо или другои биологическои жиделовека и животных.ль изобретения - повышение Цес таб ильнии. сти препарата пр неб осуществляют Спо бразоЩИ 1" ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(21) 436290 (гг) 1 г.01, (46) 07.02. (71 ) Инстит (72) ИоП.Че и В.В,Баум (53) 577.15 (56) А 11 г 1 с Вес аг Ъоху 1 а зуаве, Е С ТМаш 1 п Руг хп Епкушо 1 о р. 109-115,БхеЪег М БсМ 11 епЪег биге аког и Риг И 1 ей Ггош Вгече ВосЫшхса, 11 Я 4, р, 343(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПИРУВАТДЕКАРБОКСИЛАЗЫ ИЗ ПИВНЫХ ДРОЖЖЕЙ(57) Изобретение относится к способам получения ферментных препаратов, а именно пируватдекарбоксилазы, и может быть использовано вмикробиологической промьппленностидля выделения пируватдекарбоксилаИзобретение относится к способам получения ферментных препаратов, а именно пируватдекарбоксилазы, и может быть использовано в микробиологической промышленности для получения пируватдекарбоксилазы, используемой при ферментативном опре. делении уровня тиаминдифосфата в 5 И 255 А 1Берут свежую пастообразную массупивных дрожжей БассЬагошусея саг 1 вЪегдепвхв 7-9 регенераций и готовятсуспензию для экстрагирования белко 5ного препарата. Приготовленную суспензию обрабатывают ультразвуком счастотой 20-22 кГц в течение 1825 мин и проводят Фракционирование ацетоном и сульфатом аммония.Затем выполняют адсорбционную хрома-тографию на оксиапатите и иоиообменную хроматографию на КМ-целлюлозе,1добиваясь очистки пируватдекарбоксилазы до гомогенного состояния. Стабилизацию белкового препарата осуществляют добавлением к гомогеннойпируватдекарбоксилазе 2-3 М сульфата аммония и 0,01 -0,05 М сульфата,магния в 0,02-0,1 М Ба-Фосфатном буфере, рН 68 с последующей лиофилиэацией суспензии при -35 С. Лиофилизированный порошок хранят в плотнозакрытых тюбиках при -15 С.Наилучший эффект достигаетсяпри обработке суспензия дрожжей ультразвуком с частотой 20-22 кГц в течение 18-25 мин и добавлении к/гомогенному препарату 2-3 М сульфатааммония и 0,01-0,05 М сульфата магнияв 0,02-0,1 М Ба-фосфатном буфере,рН 6,8 . Уменьшение частоты ультразвука ниже 20 кГц или времени обработки суспензии менее 18 мин ведетк недостаточному разрушению клеток,(неполный выход продукта), а увели,чение частоты ультразвука свыше,22 кГц или времени обработки более25 мин - к частичному разрушениюпируватдикарбоксилазы,Снижение молярности Ба-Фосфатного буфера ниже 0,02 М и уменьшениеконцентрации сульфата аммония ниже2 М и сульфата магния менее 0,01 Мв исходном Ба-фосфатном буфере вецет к сниженыо стабильности препарата, Стабильность белкового препарата уменьшается в таком случаеот 2 до 5 раз. Увеличение молярности Ба-Фосфатного буфера свыше 0,1 М,а также концентрации сульфата аммо-ния более 3 М не приводит к повыше"нию эффекта по сравнению с прюеняемыми молярностью буфера или концент 1)ациями соли. Сульфат магния в концентрациях свьппе 0,05 М способствуетинактивации фермента.П р и м е р. Берут 5 кг свежихпивных дрожжей Бассйагошусея сагХяЪег. депяв 7.-9 регенераций. Свежую дрожжевую массу многократно промывают холодной водой и центрифугируют 15 мин при 5000 д. Полученную пасто- образную массу дрожжевых клеток используют для приготовления суспензии и экстрагирования белкового препаратаС этой целью 400 г дрожжевых клеток смешивают с 1750 мл воцного раствора, содержащего 67 мл глицерина, 0668 г ЗДТА, 13,2 г ИаНРО/1 и 2,8 г (11 Н) БО.Приготовленную суспензию интенсивно перемешивают в течение 10 мин. Интенсивно перемешанную суспензию охлаждают до -2 "С и обрабатывают ультразвуком при частоте 22 кГц в течение 20 мин, добиваясь полного разрушения клеток, способствующего максимальному выходу конечного продукта, Полученный экстракт центриФугируют в,течение 30 мин при 4000 ц, а затем в течение 1 ч при 105000 д, Осевшие после центрифугировакия субклеточные Фракции удаляют, а к надосадочной жидкости при непрерывном перемешивании приливают охлажденный до -20 С ацетон до 37,53-ного насыщения, не допуская нагревания раствора выше 0 С, После выдерживания 15 мин при этой температуре суспензию центрифугируют в течение 5 мин при 4000 р и осадок отбрасывают. На кажцые 100 мл надосадочной жидкости повторно приливают по 1 О мл ацетона и доводят температуру раствора до -2 С, Через 15 мин экстракт центрифугируют, а конечный осадок быстро суспендируют в 400 мп 0,02 М трис-НС 1 буфера. рН 7,3 с 1 мМ ЭДТА и 5 мМ цистеин-гидрохлоридом и перемешивают, После перемешилания втечение 30 мин при О С однородный бегп(овый раствор подвергают Фракционированню сульфатом аммония, добавляя 108 г сухого измельченного (ИН,) БО Через 1 ч смесь центрифугируют, осадок отбрасывают, а на каждые 100 мл надосадочной жидкости вносят по 7 г сульфата аммония (44-537.-ное насыщение) в течение 20 мин при перемешивании, Высоленный белок собирают центрифугированием. На данной стадии активность пируватдекарбоксилазы достигает 8,3 Е, однако присутствующие в препарате незначительные остаточные концентрации НАД Н-зависимых оксидаз приво 1541 255дят к самопроизвольному окислениюНАЛ На.Заключительную очистку проводят методами адсорбционной хроматографиина оксиапатите и ионного обмена наКМ-целлюлозе. Для достижения гомогенности 1 г грубой сульфо-аммонийной пасты растворяют в 1,5 мл0,005 М Ба-Фосфатного буфера, рН6,8 с 2 мМ Мд, 1 мМ ЭДТА, 0,5 мМтиаминдифосфатом и 5 мМ цистеингидрохлоркдом и пропускают через колонку (З,б 30 см, 48 мл/ч) с сефадексом С, уравновешенную исходнымбуфером, Значение рН и ионной силыуравновешивающего буфера подобраныэкспериментально, при которых пируватдекарбоксилаэа не связываетсяоксиапатитом и обнаруживается в первых же фракциях элюирующего раствора, тогда как сопутствующие примесивсе еще эффективно удерживались наносителе. Обессоленный белковый элюат смешивают с трехкратным объемомуплотненного осадка оксиапатита,уравновешенного этим же буфером,после экспозиции в течение 10 минпри 4 С центрифугируют в течение5 мин при 10000 г;. Адсорбент повторно промывают 3 мл буфера, надосадочную жидкость объединяют, рН доводят20 мМ ацетатом Ба с 80 мМ Ба-Фосфатом до 5,06 и наносят на колонку(2,1 Х 20 см) с КМ-целлюлозой. Пируватдекарбоксилаза не связываетсякатионообменником и элюируется Иаацетатно-Фосфатным буфером (20 и80 мМ соответственно), рН 5,06 впустом объеме колонки со скоростью36 мл/ч, Объем фракций 2 мл. Последесорбции белка значение рН элоатаувеличивается до 6,5, добавляя кфракциям по 1 мл 1 М фосфата Ба,рН 6,8. Результаты всех стадийочистки суммированы в табл. 1,Стабилизацию пируватдекарбоксилазы осуществляют сульфатом аммония в присутствии ионов Мд . К белковому элоату, содержащему 3 мг белка в 1 мл,.добавляют при перемешивании сульфат аммония и сульфат магния в 0,05 М Ма-Фосфатном буфере,рН 6,8 до конечной концентрации компонентов 2,7 и 0,02 М соответственно, после чего замороженную суспенэию лиофилизируют на установке длясублимационной сушки при температу.о,2.ре -35 С и давлении 6 10 Па, Лиофилизированный порошок хранят в плотно закрытых тюбиках при -15 С. Всеоперации по выделению и очистке пируватдекарбоксилазы проводят при+4 С,П р и м е р 2. Подготовку исходного материала, приготовление суспензии для экстрагирования белка собработкой ее ультра звуком, прове"дение ацетонового и аммонийногоФрак ционирований и заключительнуюочистку белкового препарата до гомогенного состояния проводят аналогич-.но примеру 1, Стабилизацию пируватдекарбокеилазы осуществляют сульфатом аммония в присутствии ионов МяК белковому элюату, содержащему 3 мгбелка в 1 мл, добавляют при переме 20 шивании сульфат аммония и сульфатмагния в 0,02 М Иа-фосфатном буфере,рН 6,8 до конечной концентрации компонентов 2 и 0,01 М соответственно,после чего замороженную суспензию25 лиофилизируют на установке для сублимационной сушки при температуре-35 С и давлении б 10 Па, Лиофилизированный порошок хранят в плотнозакрытых тюбиках при -1 5 С.30 Влияние стабилизирующих агентовс указанной конечной концентрацией(2 М сульфат аммония и 0,01 М сульФат магния в 0,02 М Иа-фосфатномбуфере, рН б,8) на активность пируватдекарбоксилазы показано в табл, 2.П р и м е р 3. Подготовку исходного материала, приготовление суспензии для экстрагирования белка с обработкой ее ультразвуком, проведение40 ацетонового и аммонийного Фракционирований и заключительную очистку белкового препарата до гомогенного состояния проводят аналогично примеру 1 .Стабилизацию пируватдекарбоксилазы осуществляют сульфатом аммо+ния в присутствии ионов Мд . К белковому элюату, содержащему 3 мг белкав 1 мл, добавляют при перемешиваниисульфат аммония и сульфат магния в0,1 М фосфатном буфере, рН 6,8 доконечной концентрации компонентов3 и О, 05 М соответственно, после чего замороженную суспензию лиофилизируют на установке для сублимациойной сушки при температуре -35 С идавлении б"10 Па, Лиофилизированный порошок хранят в плотно закрытых тюбиках при -15 С, Влияние стабилизирующих агентов с указанной их1541255 Таб лица 1 Удельнаяак тивность,ед, акт,/мг белка Степень очистки Стадия очистки Белок, мг Выход,%ность,ед. акт. Исходный экстракт ФракционированиеацетономФракционирование сульфатом аммонияАдсорбционная хроматография на оксиапатите Хроматография на КМ-целлюлозе 32500 32025 3170 9820 0,37 1,0 100 3,1 82 7920 8,3 22,5 65 223 5300 3820 23,8 64,3 44 375,3 33 69 64,8 конечной концентрацией (3 М сульфатаммония и 0,05 М сульфат магния в0,1 М Ба-Фосфатном буфере, рН 6,8)на активность пируватдекарбоксилазыпоказано в табл. 2.11 рименение изобретения позволяетполучить Ферментный препарат с удельной активностью 64,8 Е и выходом 31%(см, табл. 1 ), при этом весь процессполучения пируватдекарбоксилазы занимает 8 ч.Стабильность высокоочищенного фермента при +4 С в водных или буферныхрастворах в отсутствии и в присутствии стабилизирующих агентов, блокирующих реакционноспособные участкимолекулы белка или моделирующих компартментализацию Фермента в дрожжевой клетке, показана.в табл, 2,20Как видно из табл. 2, среди агентов,защищающих реакционноспособные участки молекулы пируватдекарбоксилазы(дитиотреитол, пируват, Мр;БО), наибольшим стабилизирующим эффектом обладают ионы Мд". В среде 2,7 М сульфата аммония с 0,02 М сульфатом магния в 0,05 М Иа-Фосфатном буфере,рН 6,8 белок остается активным в течение месяца. Лиофилизированныйс вышеуказанными компонентами препарат стабилен ири "15 ОС в течение года. Формула и зоб ре тения,Способ получения пируватдекарбок-, силазы из пивных дрожжей, включающий гомогенизацию клеток, Фракционирование гомогената ацетоном и сульФатом аммония с последующей очисткой на катионообменнике в 20 мМ ацетате натрия и 80 мМ фосфате натрия с рН 5,06, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повьппения стабильности препарата при хранении, гомо" генизацню клеток проводят обработкой ультразвуком с частотой 20-22 кГц в течение 18"25 мин, фракционирование ацетоном - в интервале концентраций 37,5-43,2 об.%,фракционирование сульФатом аммония - в интервале 44-53% насыщения, перед очисткой на катионообменнике осуществляют очистку на оксиапатите в 0,005 М натрийфосфатном буфере с рН 6,8, ионообменную хроматографию проводят на КМ-целлюлозе и полученный раствор Фермента лиофилизуют из раствора, содержащего 0,02-0,1 М натрийфосфатный бу- . фер с рН 6,8, 2-3 М сульфата аммония и 0,01 -0,05 М сульфата магния.ФФ зЯ эЯ О 3 ДР 8 2 ов Р б бР В й Я с; а л б О О Д; О" О О О . л с 0 в в в л, л л ф СЬ.ч ОЬ бМ Л сЧ ЧО с м сч ф сч л в в л л л 0 0 -0Л 00В 0 Л Л О Ж лО б Е Еб8 б О 3 О в О б О 3 3Х Х З ж 5 Р Ж в 1.;оо Е Я б 0 43 О 5 й О Ж ЕЯсч Об О В Р" б О И Р л Р О 3 Е О О О Я 1 О