Способ получения протеолитических ферментов

г ,О П ИС АНИЕИЗОБРЕТЕНИЯ 379101 Союз Советскиз Социалистически РеспубликК ПАТЕНТУ Ы, Кл. С 12 д 13/10 Заявлено 02.Х.1968 ( 1277123/28-13) 967,45046/6745046/67, Дания 8, Великобритания Бюллетень19 риоритет по п. 1 ОЗ.Х Дания, по п. 2 ОЗ.Х,1967 и 26.И 1.1968,35921/ публиковано 18.17,1973,Комитет по делам зобретений и открытийУДК 577.15.07(088.8) при Совете Мииистров СССРата опубликования описания ЗОХ 11. 19 Авторыизобрете Иностранцы нструп, Отто Андресен, Хелле Оиуд явите Нов СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИ ф ЕРМЕНТОВ10 ть о- е- а 10286, 0315 - 10302,2 Зависимый от патентаИзобретение относится к ферментной промышленности.Известен способ получения протеолитических ферментов путем выращивания микроорганизмов рода Вас 111 цз на питательной среде, 5содержащей источники углерода, азота в присутствии минеральных солей при щелочномзначении рН среды и аэрации с последующимвыделением ферментов из культур альнойжидкости.Предлагаемый способ позволяет получиферменты, обладающие оптимальной протелитической активностью по отношению к гмоглобину. в присутствии мочевины при знчении рН не менее 1 О. 1Для этого рН среды устанавливают на значении 8,5 - 10,5, а в качестве микроорганизмов используют один из штаммов, находяшихся на хранении в Национальной Коллекции Промььшленных бактерий, Исследовательской станции Торри, Абердин, Шотландия.под10144, 10148, 10281, 10284,10288, 10301, 10304, 10306 в 103, 110327, 10282, 10287, 10291, 10293,10314, или их мутанты.Способ заключается в следующем.Производят культивирование бактерий рода Вас 111 цз на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных солей при аэрации и рН среды 7,5 - 10. 3 2В качестве источника углерода используют карбогидраты, такие как сахароза, глюкоза, рахмал, мука из зерен хлебных злаков, рис. сорго и др. Концентрация кароогидратов составляет 25 - 10/О, наиболее оптимальная 8 - 10% (процент вычисляется по декстрозе).Присутствие в питательной среде карбогидратов способствует образованию кислотных компонентов, в результате чего рН среды прп культивировании снижается. Так как рН среды необходимо поддерткивать в пределах 7 - 12, необходимо его измерять, Для поддержания среды в указанных пределах можно определенное количество карбогидратов вводить вместе с буферным веществом. Карбонаты и особенно сесквикарбонаты, используемые в концентрации 0,2 М в среде, способны поддерживать рН среды 10.5 и 9,3 соответственно,Могут применяться и другие буферные смеси, например фосфатные. Карбогидраты можно вводить небольшими порциями в течение всего процесса, Можно использовать автоматическое регулирование рН добавлением различных подшелачиваюших веществ,Источники азота могут быть использованы неорганической и/или органической природыПодходящими неорганическими источниками азота являются нитраты и соли аммония, а органическими - соевая мука, мука семян20 45 50 55 60 д 5 19Вид 11 (принадлежащий к морфологическойгруппе 1, согласно Вегдеу).С 335, С 341.Морфология. Вегетативные палочки размером 0,3 - 0,4 Х 1,5 - 2,5 мк,Споры образует. Размер их 0,3 - 0,5)(К 0,8 - 1 мк от центральных до парацентральных, от овальных до цилиндрических, тонкостенные.Спорангии очень мелкие или отсутствуют,разбухание спорами,Гр амположительный.Почти нет роста на питательном агаре прирН 7,3.Максимальная температура для роста 37 С.Нет или скудный рост на глюкозном илиманнитовом агаре с нитратом в качествеединственного источника азота.Крахмал не гидролизует.Вид 111.Морфология. Вегетативные палочки размером 0,6 - 0,7 Х 1,5- - 3,5 мк с закругленнымиконцами.Споры эллипсоидальные размером 0,7 -0,9;(1,0 - 1,2 рпарацентральные до субтерминальных, толстостенные,Некоторые спорангии отчетливо вздутые.Палочки в спорулированных культурах разбухают и растут очень толстыми, но сохраняют их оригинальный вид. Спорулирующиекороткие палочки могут иметь глобулярнуюформу на даиной стадии, Таким образом, нетлокального разбухания на месте, где размещается спора, хотя некоторые спорангии веретенообразные,Разновидность а,С 326, С 324.Грамположительный,Рост отсутствует или только незначительный на питательном агаре при рН 7,3.Максимальная температура для роста 50 С.Рост отсутствует или только скудный наглюкозном или маннитовом агаре при рН 9,7с нитратом в качестве единственного источника азота,Крахмал гидролизует, при этом образуетсяширокая зана гидролиза.Разновидность 6,С 347, С 350,Грамположительный.Умеренный рост на питательном агаре прирн 7,З.Максимальная температура для роста 50 С.Недостаточный рост на глюкозном или маннитовом агаре при рН 9,7 с,нитратом в качестве единственного источника азота.Крахмал гидролизует, зона гидролиза широкая.Разновидность с,С 337, С 340,Грамотрицатеяьный или грамизменчцвый.Умеренный рост на питательном агаре прирН 7,З.Максимальная температура для оо,та 37 и50 С 5 10 15 20 25 30 35 40 Недостаточный рост на глюкозном илиманнитовом агаре при рН 9,7 с нитратом в качестве единственного источпика азота Крахмал гидролизует с образованием широкой зоны тидролиза.Разновидность д.С 338, С 343, С 346, С 343, С 349.Грамизменчивый или грамотрицательный,Рост на питательном агаре при рН 7,3 умеренный.Максимальная температура для роста 45 - 50 С.Рост отсутствует или очень незначительный на,глюкозном или маннитовом агаре прирН 9,7 с нитратом в качестве единственногоисточника азота.Крахмал гидролизует с образованием широкой зоны гидролнза.Разновидность е.С 324, С 355,Грамположительный.Роста нет или только очень незначительныйна питательном агаре при рН 7,3.Максимальная температура для роста 45 -50 С.Умеренный рост на глюкозном или маннитовом агаре,при рН 9,7 с нитратом в качествеединственного источника азота.Гидролизует крахмал с образованием широкой зоны гидролиза,Разновидность .С 353,Грамотрицательный.Умеренный рост на питательном агаое прирН 7,З.Максимальная температура для роста 50 С.Умеренный рост на глюкозном или маннитовом агаре при рН 9,7 с нитратом в качестве источника азота.Гидролизует крахмал с образованием широкой зоны гидролиза,Вид М 1 Ч (принадлежащий к морфологической группе 11, согл асио Вегдеу) . Морфология. Вегетативные палочки размером 0,4 - 0,5 Х 2 - 3 мк часто встречаются в виде длинных цепочек.Образует споры овальные, субтерминальные толстостенные, легко окрашенные, размер ом 0,6 - 0,8 Х 0,7 - 0,9 мк.Спорангии отчетливо вздутые, булавовидные,Разновидность а,С 303, С 354, С 357, С 366, С 367, С 371, С 375, С 378,Грамотрицательный.Рост умеренный до хорошего на питательном агаое при рН 7,3.Максимальная температура для роста 57 С.Рост умеренный до хорошего на глюкозном или маннитовом агаре при рН 9,7 с нитратом в качестве единственного источника азота.Крахмал гидоолнзует с образованием уме. ренной зоны гидролпза,Штаммы Виды15 а С 300, С 301, С 360, С 372, С 374 20 С 302, С 334 С 323, С 339, С 352 С 369С 304. С 311, С 336 25 С 335, С 341 П С 326, С 342 С 347, С 350 С 337, С 340 30 П 1 С 338, С 343, С 346, С 348, С 349 35 С 324, С 355,С 353 40 С 303, С 354, С 357, С 366, С 367, С 371, С 375, С 378 1 Ч С 351, С 356, С 364, С 376, С 377, С 411 45 С 358, С 410 50 С 365, С 412 Ч С 373 Ч 1 С 325, С 413 С 370 ЧП 60 21Разновидность о,С 351, С 356, С 364, С 376, С 377, С 411.Грамизменчивый.В других отношениях похож на разновидность а.Разновидность с:С 358, С 410.Грамположительный,,В других отношениях как разновидость а.Вид Ч (принадлежащий к морфологическойгруппе 11, согласно Вегдеу).С 365, С 412. Морфология, Вегетативные палочки, прямые, встречаются слегка, изогнутые, размером 0,3 - 0,4 Х 2 - 4 мк.Споры размером 0,6 - 0,7)(0,9 - 1,2 мк, овальные до эллипсоидальных,;парацентральные,до терминальных, толстостенные, слегка окр ашенные,Спорангии отчетливо вздутые, булавовидные до ракетковидных,Грамположительный.Рост умеренный до хорошего на питательном агаре при рН 7,3.Максимальная температура для роста 57 С.Хороший рост на глюкозном или маннитовом агаре при, рН 9,7 с нитратом в качестве единственного источника азота,Гидролизует крахмал с образованием зоны гидролиза от умеренной до широкой.,Вид И (принадлежащий к морфологической группе 11, согласно Вегдеу). Морфология. Вегетативные палочки слегкаизогнутые, концы заостренные, размером0,25 - 0,35 Х 2,5 - 5 мк, Споры от овальных до эллипсоидных, отсубтерминальных до терминальных, размером 0,8 - 1 Х 1,1 - 1,3 мк. Спорангии отчетливо вздутые, булавовидные, встречаются формы барабанной палочки. Разновидность а. С 373. Грамотрицательный. Рост отсутствует или только очень незначительный на питательном агаре при рН 7,3. Максимальная температура для роста 50 С. Рост отсутствует или только очень незначительный на глюкозном или маннитовомагаре при рН 9,7 с нитратом в качестве едичственного источника азота. Гидролизует крахмал с образованием широкой зоны гидролиза, Разновидность О. С 325, С 413. Грамположительный. Умеренный рост на питательном агаре прирН 7,3, Максимальная температура роста 50 С. Рост отсутствует или только очень незначительный на глюкозном или маннитовом агарепри рН 9,7 с нитратом в качестве единственного источника азота. Крахмал гидролизует с образованием широкой зоны гидролиза.Вид И 1.С 370.Этот штамм экспериментально классифицирован как новый вид.Он, является аспорогенным или олигоспорогенным и, следовательно, не может быть ломещен в какую-нибудь морфологическую группу. Он наиболее вероятно относится к щелочным бактериям, которые принадлежат к морфологической группе 11 рода Вас 1 цз (соглас по Вегдеу),379101 Таблица Рост на ннтрате (УОз) как единственном источ- нике Широта зоны гидролнза на крахмальном агареМаксимальная скорость роста при рнМаксимальная температура роста Рост на питатель. ном агаре при рН 7,3Гидролиз крахмала Вид Грамм цвет 8,0 - 9,5 8,0 - 8,5 8,3 - 8,8 9,0 - 8,6 50 - 55 40 - 50 37 - 5037 скудныйскудныйплохойплохой+ 1 + + 8,0 - 9,0 37 плохой плохой плохой плохой плохой плохой505037 - 5045 - 5045 - 5050 плохой8,0 - 8,5 57 ЧП 23Вегетативные палочки часто в длинных цепочках, нитевидные, концы слегка заостренные нли закругленные, размером 0,3 - 0,5 Х 2 - 5 мк.Грамотрицательный.Рост от умеренного до хорошего на питательном агаре при р Н 7,3.Максимальная температура для роста 57 С.Хороший рост на глюкозном или маннитовом агаре при рН 9,7 с нитратом в качестве единственного источника азота,Гидролизует крахмал с образованием умеренной зоны гидролиза.Следующие признаки являются общими для ряда штаммов, принадлежащих к различным разновидностям в видах 1 - 1 Ъ.Желатин - гидролизует.Казеин - гидролизует.На агаре с глюкозой рост такой же, как на питательном агаре.На соевом косом агаре рост более обильныи и мягче, чем на питательном агаре,Тирозиновый косой агар, Рост такой же, как на питательном агаре.Питательный бульон. Средняя мутность с обильным осадком,24Пленки нет или образуется пленка тонкаяи хрупкая.Бульон с ХаС 1. Хороший рост при 5%-нойконцентрации ИаС 1; растет при 7%,5 Лцетилметилкарбинола не образует.Восстанавливает нитрат в нитрит.На глюкозном бульоне в анаэробных условиях при рН 7,8 или выше за 14 дней (рН среды доводится до 9 перед инокуляцией) рост10 скудный,На основе таксономических исследованийизобретателей штаммы рода Вас 1 Ицз, перечисленные в табл. 1, классифицируются следующим образом (см. табл, 8),15 Все эти виды выращиваются также на питательном агаре и соево-бобовом агаре, а некоторые из них на глюкозном и маннитовом питательных агарах с целью наблюдения формы, 20 виды и цвета колонии. В табл. 9 приведены свойства, вариациикоторых образуют основу для разделения разновидностей внутри различных морфологиче ских групп.Составитель Т. Полянская Техред Т. Миронова Корректор Л. Бадылама Редактор А. Бер Заказ 1921/13 Изд. Мо 483 Тираж 467 ПодписноеЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССРМосква, Ж.35, Раушская наб., д. 4/5 Типография, и р. Сапунова, 2 1. Способ получения протеолитических ферментов путем выращивания микроорганизмов рода Вас 111 цз на питательной среде, содержащей источники углерода, азота в присутствии минеральных солей при 1 целочном значении рН среды и аэрации с последующим выделением фермента из культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью получения ферментов, обладающих оптимальной протеолитической активностью по отношению к ге 26моглобину в присутствии мочевины при значении рН не менее 10, рН среды устанавливают на значении 8 - 10,5.2. Способ по п. 1, отличающийся тем, чтодля выращивания используют один из штаммов рода Вас 111 цз, находящихся на хранении в национальной коллекции Промышленных бактерий, Исследовательской Станции Торри, Абердин (Шотландия) под10144, 10148, 10 10281, 10284, 10286, 10288, 10301, 10304,10306 в 103, 10315 в 103, 10282, 10287, 0291, 10293, 10302, 10314, или их мутанты,хлопка, арахсовя худ, казеР кукурузный и дрожжсвой экстрактымочевина, альбумип. Ку,ьтивроваие осуществляют при 25 - 55 С (предпочтительно при 30 - 40 С).Максимальная активность протеолитических ферментов достигается после культивирования в теченне 1 - 5 суток.К льтивироване бактерий осуществляется как глубинным етодом при аэрации, так и онерхостн м.При поверхсотном культивировании используется среда, содержащая 10 г пшеничных отрубей, 2 г Ма,РО 12 НО и - 10 лл воды. Перед инокуляцией рН среды устанавливают на значении около 10 с помощью 2 мл ХаОН. Данным методом культивируют штамм С 300 и С 303. Активность полученных ферментов около 20 ед, Апзопа на 1 кг пшеничных отрубей,Активность ферментов определяется с помощью гемоглобинового метода Апзопа (Апзоп доцгпа 1 о уепега Ртузооду, 22, (9 - 89, 1939).Одна единица Апзопа означает количество протеолитического фермента, расщепляющего гемоглобин при рН 10,1 и температуре 25 С в течение 1 О мин с такой первоначальной скоростью, при которой в 1 мин образуется такое количество продуктов расщепления, которое не может осаждаться трихлоруксусной кислотой, чтобы эти .продукты расщепления дали тот же цвет с фенольным реагентом, какой дает олин миллиэквивалент тирозина,Для культви;:ования видов и штаммов используют две среды:Среда ВРРА со следующим составом, г/л водопроводной воды:Картофельная мукаСахарозаЯчменная мукаСоевая мукаКазеинат натрияХаНРО 12 НОР 1 ецгопс Среда В 8 Х со следующим составом г/л водопроводной воды:Ячменная мукаСоевая мукаР 1 ецгопс Обе эти среды доводятся до требуемого значения рН добавлением сесквнкарбоната или соды в стерильных условиях. Присутствующий крахмал нейтрализуется а-анилазой,Эксперименты проводятся в 500 мл встряхиваемых колбах, каждая из колб содержит 00 л,г питательной среды ВРРА и ВЯХ соответственно, которые стерилизуются в авто- клаве в течение 90 мин при 120 С. После обработки в автоклаве значение рН доводится до 9,3 - 10,5 с помощью сесквикарбоната натрия, Для каждой бактерии используется четьре колоы, и прооы из культу)альных 5 10 15 20 25 Зо 35 40 45 50 55 60 65 сред для определения активности фермента, гыраженного в единицах Апвоп, берутся после культивирования через 3, 4, 5 и 6 дней соответственно. Колбы при культивировании помещаются на вращающийся стол с 240 об,мин.В табл. 1 приводятся максимальные выходы энзимов и значения рН.Питательные средства ВРГА и В 5 Х используются также для культивирования в емкостях в глубинных условиях при искусственной аэрации.В табл. 2 приведены данные культивирования при 34 С на пилотной установке в 550 л емкостях.При других культивированиях на пилотной установке используются другие штаммы с варьируемыми составами питательной среды, В остальных цистернах культивируется штамм С 303 в четырех вариантах с различными условиями.Композиции культуральных сред, условия культивации и полученные результаты даются в табл. 3,Протеолитические ферменты выделяют из культуральной среды путем удаления клеток бактерий центрифугированием и осаждения ферментов из фугата добавлением а,зО. или этанола. Образовавшийся осадок отделяют фильтрованием на кизельгуре и полученный осадок су.шат.Примеры выделения ферментов приведены в табл. 4.Исходные материалы, упомянутые в табл.4, получают культивированием в 550 л цистернах из нержавеющей стали при искусственной аэрации, рН питательных сред устанавливается первоначально с помощью 2 М раствора аСОз.Испытание протеолитических ферментов, показывает, что между ними есть существенные различия, относящиеся к ряду их свойств.По протеолитической активности ферменты мотут быть разделены на три группы или типа. Протеолитическая активность измеряется при рН 12 и выражается в процентах максимальной активности:Тип 1 100 - 80Тип 2 80 - 50Тип 3 50 - 0Известно на практике, что ионы кальция стабилизируют активность большинства протеолитических ферментов. Новые ферменты, продуцируемые бактериями, перечисленными в табл, 1 и разделенные на виды и разновидности, испытывают в отношении стабилизирующего действия ионов кальция в концентрации 0,01 М и при рН 10,5 или 11. Стабилизация выражается в, процентах остаточной активности после выдержки в течение 30 мин прн 50 С.Результаты испытания типов ферментов и стабилизирующего эффекта ионов кальция приводятся в табл, 5, в которой плюс означает, что остаточная протеолитическая активТаблица 1 ВБХ, единицы Апвоп на 1 кгрн рн Вид среды среды 10,0 9,2 9,5 9,3 С 323 С 339 С 323 С 323 9 19 33 16379101 Таблица 2 Штамм С 324С 335С 339С 347С 351 Среда Показатели ВРРА ВБХ ВРгА ВРРА ВРРА 10,2340,3839,35 10,2340,25598,9 10,2340,25349,2 10,5340,25979,1 9,334 0,353 8,3 Значение РН перед инокулированием Температура культивирования, С Воздух, м /минВремя культивации, часКонечное значение РНКонечная протеолитическая активность,выраженная в единицах на 1 кг суб- страта 33 29 48 44 40 Таблица 3 Номер культивации 150 45 0,03 200 60 0,03,иниц 4000 об/мин (30 мин) 10 С 1200 мл С,Н,ОН 3000 об,мин (30 мин) 135 С, 85 кг Хаг 304, отстаивание 1 час Осаждение Никакой (центрифугирование) 30 мин при 4000 об/мин; промывка 600 л 4 л С,Н,ОН при 0 С, центрифугирование 4000 об/мин 10 мин 2,25 кз кизельгуровый фильтр-пресс фильтр-пресс Фильтрация Сушильная камера (40 С) Вакуум Р,О СушкаПорошок фермента 1300 г, содержание 0,8 ед. Апвоп на 1 г 9,7 г, содержание 1,3 ед, Апвоп на 1 г 1600 ед. Апвоп=25 о,Выход 1020 ед, Апвоп=94 12,6 ед. Апвоп=65%. Условия культивации и культуральные средыЯчменная мука г/лСоевая мука г/лРеигопс, мл/лИа,СОг (стерильная добавка переди нокул прова ни ем)РН перед инокуляциейТемпература культивации, СВоздух, мз/минВремя культивации, часМаксимальное значение рНМаксимальные единицы Апвоп на 1 кг 250 кг культуральной жидкости, содержащей 25 ед,Апвоп на 1 кг Центрифугирование 3000 об/мин (30 л 4 ин) 35 С, 85 кг/Иа 304, отстаивание 1 час Сушильная камера (40 С) 4000 г содержание О,4 ед. Апвоп на 1 г 0,2 М10,0340,31259,367 0,2 М10,0340,31049,380 0,4 М10,1340,31269,366Вид Штамм ы Разновидность Тип энзима С 300, С 301, С 360С 372, С 374С 302, С 334С 323, С 339, С 352,С 369С 304, С 311, С 336т)С 335, С 341 С 326, С 342С 347, С 350С 337, С 340С 338, С 343, С 346С 348, С 349С 324, С 355 С 353 С 303, С 354, С 357 С 366, С 367, С 371,С 375, С 378 1 Ч С 351, С 356, С 364, С 376, С 377, С 411 С 358, С 410 С 365, С 412 С 373 Ч 1 С 325, С 413 ЧП С 370 ность в отсутствии иолов кальция является ниже 80% соответствующей активности контроля (в присутствии ионов кальция), а минус означает, что остаточная протеолитическая активность в отсутствии ионов кальция является выше 80% соответствующей активности контроля в присутствии ионов кальция. Протеолитическая активность ферментов,продуцируемых штаммами, перечислеиными в табл. 5, испытывается не только при рН 12,но также при более низких его значениях,5 Новые ферменты подвергают следующим испытания,м; а) Стабильность против триполифосфата12 Испытания проводятся 30 мин при 50 С и при рН 10; метод анализа - нитро-казеиновый (Е. Ч. РесЬпапп, В 1 осйеппзсйе Уе 11 всЬгШ, Вс 1.321, 248 - 260/1950) .5 Определяется стабильность ферментов в растворе, содержащем 0,2% триполифоофата. Стабильность выражается в процентах остаточной активности спустя 50 мин, при 50 С при рН 10. Концентрация фермента 0,1 ед, Апзоп на 1 л (по методу Апзопа). Цифры в табл. 6 расшифровываются следующим образом:цифра над строкой показывает процент остаточной активности, когда анализ выпол 10 няется сразу после добавления поверхностноактивного вещества, то есть данная цифрадает показатель первоначальной степениинактивации;цифра под строкой показывает разницу15 между данной первоначальной остаточнойактивностью и процентом остаточной активности спустя 30 мин.д) Оптимальная температура,Температура дана в градусах Цельсия, при20 которой была найдена максимальная актявность при рН 10. (Методом анализа был метод Апзоп).е) Тип фермента.Найдено, что все ферментные препараты25 ингибируются моментально с полностью фенилметилсульфонилфторидом. Это означает,что все ферменты в активном центре имеютсерии.1) рН - устойчивость,30 Стабильность,при различных значениях рНопределяется в отношении пяти ферментныхпрепаратов при следующих условиях: выдерживание - 24 нас при 25 С; значения рН -5 - 7 - 8 - 10 - 12; концентрация фермента35 0,2 ед, Апзоп на 1 л,Результаты приводятся в табл. 6.Соответствующие растворы с 0,01 М СаСг показывают остаточную активность во всех случаях 80 - 100%.б) Стабильность против пербората, Определяется активность раствора, содержащего фермент и перборат натрия в количестве 0,1%. Стабильность выражается в процентах остаточной активности спустя 30 мин при 50 С и рН 10. Концентрация фермента и методика анализа такие же, как в испытании а.с) Стабильность против поверхностно-активных веществ.Стабильность растворов, содержащих фермент и различные поверхностно-активные вещества, определяется при использовании трех типичных поверхностно-активных веществ в концентрациях, соответствующих концентрациям, применяемым в моющем растворе:Мыло 0,25 г/л ДВЬ - алкил-арилсульфонат(50% -ный) 2,5 г/л ТАЯ - сульфат жирного спирта(25% -ный) 5,0 г/лКоннепрация фермента О,1 едЛп.он на 1 л Табл и ца бЛктивиость, Типлциипы 1 э виАпэоп иа1 г при рН ма Стабильиость Энэимиыйпрепаратв видепорошка, г Оптимальная температура, С Поверхностно-активные веществаПерТРР рН а Мло ДВЗ ТЛЗ 6,0 - 10 5 5,0 - 11,0 6,0 - 10 5 6,3 - 10,36,3 - 11,0 С 300 С 301 С 302 С 303С 304 С 334 С 351 С 354 С 360 С 364 С 365 С 366 С 367 С 370С 371 С 372 С 376 С 377 С 335 С 3:9 С 369 С 347 2 2 3 600 2,5 1500 9 42 117 456 2000 26 500 3000 50 430 17 213 1500 217 7,2 573ЫС 1 В: ф Источник выделения Метод обогощсиил С 300 10144 С 301 10145 С 302 10146 С 303 10147 С 304 10148 С 311 10281 Пербэратовый агар С 323 10282 То ьхс С 324 10283 С 325 10284 С 326 10385 С 334 10286 Перборатньш агар Перборатный агар Черборатн и навоз Перборатная заготовка С 335 10287 С 336 10288 С 337 10289 Гкина с травяного поля иэ АвсЬеЬсгл, Но- з 1 е)п С 338 10290 Псрборатнал заготовкаПсрборатпый агарПсрборатныи агарПерборатный агаг.Садовая заготовкаПереработаишш аг"р С 339 10291 С 340 10292 С 341 10293 С 342 10294 С 343 10295 С 346 10296 С 347 10297 С 348 10298 С 349 10299 Олений навоз из оленьего парка вблизи Копенгагена С 350 10300 С 351 10301 Куриный помет С 352 10302 9,2 - 9.6) Почва с кладбища в Копенгагене Почва с кладбища в КопенгагенеПочва с речного берега в Копенгагене Груда почвы и листьев с кладбища в Ко пенгагеие Древесный песок на В 1 оЫшз. яи 11 апс Лесная почва из АзсЬеЬег, Нов 1 е 1 пПолевая почва из Датского городка Почва с берега озера нз АзсЬсЬегц, Но)- з 1 е)п Инфекция на пластинке с перборатными отверстиями Инфекция на пластинке с перборатными отверстиями Почва с берега реки из Даского городаПочва из сада Датского городаКонский и слоновый навоз Почва с кладбища в КопенгагенеПочва с речного берега Датского города Почва с речного берега Датского города Полевая почва из Датского городаСадовая почва из Датской деревни Садовая почва пз Датского города Почва с птичьего двора 1 курлтника) из Даткого города Олений навоз из оленьего парка вблизи Копенгагена Почва с птитьего загона 1 курятника) Вода из Копенгагенского озера Страусосьш помет из зоопарка Крахмально-казепновая среда 1 рН полни мается постепенно от 10 до 12) Посев образцов почвы На агарс с сссквикарбоисо. 11)11=9,0 .,Испытание зон гидро:и га на нейтральном агаре со снятыми сливками Шелонь, снятые сливки, агаров.е пластинки, заполненные перборатом натрия Многократное удобрение щелочным крахма. лом Многократное удобрение щелочным крахма- лом Многократное удобрение щелочна:,. крахма- лом Шелочно крахмально-казсииовал среда стриполифосфато: Термофильиое сесквиркарбоиат:.ос; поори. иие 150 С, рН 8,6 - 9,7) Узобретени сссвикароиатом из г;и.", г р 11379101 16 Продолжение Источник выделения Метод обогощения номер С 353 10303 Навоз слона 10304 С 354 Почва с куриного двора Почва с куриного двора С 355 10305 С 356 10306 Садовая кора 10307 С 357 Почва с куриного двора 10308 С 353 Почва с куриного двора 10309 С 360 Переработанный агар 10310 С 364 10311 С 365 Отрубно-садовое удобрение 10312 С 366 10313 С 367 Слоновый навоз 10314 С 369 Страусовый помет 10315 С 370 Узобрение щелочной маниит - КЬ)О,10316 С 371 Слоновый навоз 10317 С 372 Крахмально-казеиновое моющее удобрение Садовая почва из Датского города С 373 10318 Переработанный агар С 374 10319 С 375 10320 Страусовый помет из зоопарка С 376 10321 Слоновый навоз 10322 С 377 Вода из бассейна гиппопотама 10323 С 378 Маннит - КЬ)Оз удобрение С 379 10324 С 411 10325 10326 С 412 С 413 10327 ф Номер, под которым бактерия находится в национальной коллекции промышленных бактерий. СсылочныйХС 1 В: ф Садовая почва из Датского городаСоскоб с унитаза (туалетного резервуара) А(идкость из сыромятно-известковой ванныДетский кал Соскоб с сыромятно.известковых контейне- ров Глина с травяного поля из АзсЬеЬегд, Но е 1 П Глина с травяного поля из ЛзсЬеЬегд, Но. з 1 епт Соскоб с сыромятно-известковых контейне. ров Тигриный навоз Голубиный пометПочва с куриного двора из Датского го. рода Глина с травяного поля из Лзс 1 тсЬег, Но 1- з 1 е 1 п Узобретение сесвикарбонатом натрия (рН 9,2 - 9,6) Удобрение на основе нитрата глюкозы при 40 С Удобрение на основе нитрата глюкозы при 40 С Удобрение на основе нитрата глюкозы при 50 С Удобрение на основе нитрата глюкозы при 50 С Удобрение на основе нитрата глюкозы при 50 С Термофильное сесквикарбонатное удобрение (50 С, рН 8,8 - 9,7) Крахмальное удобрение (рН 11) с неор. ганическим азотом Термофильное сесквикарбонатное удобрение (50 С, рН 8,8 - 9,7) Протеоза пентон (встряхиваемые колбы) рН 9,7 Протеоза пептон (встряхивание колбы) рН 9,7 Натриевая соль этилендиамин тетрауксус.ной кислоты крахмально-казеиновое удоб- рение Натрийсесквикарбонатное удобрение (рН 9,2 - 9,6) Натрийсесквикарбонатное удобрение (рН 9,2 - 9,6) Термофильное казеиновое крахмальное удобрение с Ь)аОН Термофильное сесквикарбонатное удобрение (50 С рН 8,8 - 9,7) Картофельная мука и натрийсесквикарбо. натная заготовка Крахмальное удобрение (рН 11) с неорга. ническим азотом45 роста 37 -50 55 60 65 В табл. 6 показан интервал рН, в котором была найдена остаточная активность порядка 80 100 о/оИспытание ферментных препаратов, полу- ченных с помощью штаммов С 303 и С 347, по отношению к сульфиту натрия показывает, что ферменты не чувствительны к даиному восстанавливающему агенту, из чего следует, что 8 - Ь мостики не сушественны для третичной структуры ферментов.Из табл. 6 видио, что ряд ферментных,препаратов показывает удивительные свойства стабильности,Ферментные препараты или композиции, согласно изобретению, состоят из твердой или жидкой смеси протеолитических ферментов и других компонентов, количество и состав которых зависят от цели и технической или научной области, в которой намереваются использовать их,Ферментные препараты или,композиции могут состоять из,гранул, могут быть в виде суспензии,или раствора, содержащего стабилизаторы.,Полученные ферменты используют в небольших количествах (не более 10 вес. /о).Эти ферменты используют в моющих, депилаторных композициях, в препаратах для тидролиза протеинов, в установках для очистки канализации, в орошающих композициях и в качестве септических добавок в резервуары,Для получения, протеолитических ферментов осуществляют культивирование новых видов Вас 11 цз, выделенных из различных образцов почв, навоза животных и других источников.Для выделения новых видов бактерий рода Вас 11 цз источники выделения (например, почву, навоз) помещают в питательные среды, имеющие значение рН 9 - 11, а затем выделяют бактерии, способные расти при указанных рН, и подвергают их исследованиям.Для выделения используют и методы удобпения (витаминизирования), известные в промышленности.Характеристики вновь выделенных штаммов приводятся в табл, 7. Таксономические исследования всех этих членов рода Вас 11 цз осуществляются при использовании, методов, описанных Ягп 1 Йопт, богдоп ц С 1 агЕ Ь АегоЫс Браге 1 оггп 1 пд Вас 1 ега, 11. 8. Оераг 1 гпеп 1 о Адг. монография Мо 16 (1952). Эти методы до настоящего времени считаются наиболее подходящими, но они должны видоизменяться в виду того, что все питательные среды должны устанавливаться на более высокой величине рН, чем та, которая указывается Смитом, хоггоп ц Саг 1, потому что все виды Васцз, перечисленные в табл. 7, растут при,повышенных значениях рН,Бактерии могут разделяться довольно точно,на морфологические группы. Эти группы отличаются друг от друга до такой степени,5 10 15 20 25 30 35 40 что в действительности представляют отдель.ные виды.Внутри морфологических групп встречаются различия в биохимических реакциях. Наоснове этих различий группы подразделяютсяна разновидности, которые представляютсяодним или более штаммами,Вид 1 (принадлежащий к морфологическойгриппе 1 в соответствии с Вегоеу).Морфология. Вегетативные палочки размером 0,5 - 0,7 Х 1,5 - 4 мк, образует споры размером 0,5 - 0,8)(0,8 - 1 мк от центральных досубтерминальных, Встречаются споры овальные, цилиндрические, тонкостенные.Разновидность а.С ЗООС 301, С 360, С 372, С 374.Грамположительные.Рост на питательном агаре при рН 7,3 и9,7 хороший, Максимальная температура дляроста 50 - 55 С,На глюкозном или маннитовом агаре с нитратом в качестве единственного источникаазота при рН 9,7 рост скудный или отсуствует.Крахмал гидролизует.Через семь дней зона гидролиза узкая.Разновидность б,С 302, С 334.Грамположительный,Рост на питательном агаре при рН 7,3 гораздо медленнее в течение первых двух дней,после этого почти сравним с ростом на питательном агаре при рН 9,7,Максимальная температура для роста 40 -50 С.На глюкознэм или маннитовом агаре прирН 9,7 с нитратом,в качестве единственногоисточника азота рост скудный или отсутствует.Гидролизует крахмал; при этом образуетсяширокая зона гидголиза. Разновидность с,С 323, С 339, С 352, С 363.Граыположительный или грамизменчивый,Рост умеренный до скудного на питательном агаре при рН 7,3,Максимальная температура50 С.На глюкозном или манннитовом агаре с нитратом в качестве единственного источника азота рост скудный. Гидролизует крахмал,зона гидролиза широкая.Разновидность АС 304, С 311, С 336.Грамположительные палочки.Рост умеренный до окудного на питательном агаре при рН 7,3,Максимальная температура для роста37 С.Скудный рост на глюкозном или маннитовом агаре при рН 9,7 с нитратом в качествеединственного источника азота.Крахмал не гидролизует.