334720

О П И С А Н И Е 334720ИЗОБРЕТЕНИЯ бсюа Советскив Сбциалистических РеспубликК ПАТЕНТУ Зависимый от патентаМ, Кл. С 12 д 13/10 А 611 19/00Заявлено 20.1,1970 ( 1415654/30-15) Приоритет 21.11.1969,9619/69, Великобри- тания Номитет по деламиаобретений и открытийпри Совете МинистровСССР Опубликовано 301972. Бюллетень12 УДК 577.15,07:577.151.Дата опубликования описания 28.1 Ч.1972 Авторизобретенияизаявитель Иностранец Мишель ОреманСПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТНЫХ ПРОДУКТОВ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ВЯЗКОСТИ КИШЕЧНОЙ, БРОНХИАЛЬНОЙ И ЦЕРВИКАЛЬНОЙ СЛИЗИИзобретение кааается способов получения ,ферментных продуктов, расщепляющих белок, основное свойспво которых - способность вызывать оптимизацию вязкости слизи в живом организме, особенно, вязкости кишечной, бронхиальной и цервикальной слизи.Цель изобретения - создание ферментов, которые отличаются способностью оптимизировать вязкость кишечной слизи и увеличивать таким образом скорость поглощения перевариваемой пищиа-,также различных добавок, вводимых, перорально.Кишечная слизистая оболочка, как и все слизистые оболочки, защищена от вредного влияния окружающей среды слизью. Вязкость слизи определяется наличием макромолекул слизистого вещества и мукополисахаридов, которые соединяются между собой протеиновыми мостиками и образуют плотную сетчатую структуру.Кишечная слизь является барьером между слизистой оболочкой и пищевым комком, Этот барьер препятствует слишком тесному контакту кишечной стенки с крупными молекулами ферментов внутреннего происхождения (трипсинами и хемотрипсинами), которые вызывают переваривание пищи, но могут вредно воздействовать на слизистую оболочку. Однако барьер должен легко пропускать малые молекулы перевариваемой пищи. Если кишечная слизь слишком вязка, тоона тормозит проход в кровь перевариваемых пищевых элементов, если вязкость слизи недостаточна, то она теряет свою защитную 5 роль слизистой оболочки, Между этими двумя величинами редко бывает оптимум,Установлено, что при помощи промышлен.ных операций брожения можно изготовить расщепляющие белок ферменты, способные в 10 живом организме сообщить кишечной слизиоптимум вязкости.Обычные расщепляющие белок ферменты,которые были испытаны как добавки в корм или питье для животных, оказывают либо 15 слишком слабое, либо слишком значительноедействие на вязкость слизи.Получаемые же по изооретению протеолптические ферменты оптимизируют вязкость слизи.20 Кроме того, установлено, что оптимизациявязкости слизи и, следовательно, повышение скорости поглощения перевариваемых пищевых элементов увеличивают скорость роста животных и уменьшают их коэффициент по требления.Опособ получения протеолитических ферментных продуктов, предназначенных для оптимизации вязкости кишечной, бронхиальной и цервикальной слизи, заключается в том, чтс 30 на питательной среде, содержащей источникиазота, углерода и минеральных солей приаэрации среды воздухом культивируют грибпродуцент 51 гер 1 отусез 1 гайае, предпочтительно штаммы1998 и 2019 (МдзецгпМа 1 опа 1 сГНЫо 1 ге Капге 11 е с 1 е Рапз), а культивирование ведут до тех пор, пока конечныйтитр среды не достигнет 3000 ед, Ансома(ед. А.) на 1 мл среды.При этом используется жидкая среда, содержащая 30 г соевой муки, 30 г глюкозы,0,8 г динатрийфоофата, 10 г карбоната кальция в расчете на 1 л среды, рН среды около7,0, Аэрация воздухом из расчета 0,3 объемавоздуха на 1 объем среды в 1 мл. Культивирование ведут при температуре 28 С в течение 60 - 84 час.В результате брожения получают ферментные продукты, снижающие вязкость кишечной слизи в пределе от 35 до 650 и в то жевремя устойчивые к ингибиторам трипсина.Полученные в результате брожения продукты могут быть концентрированы или очищенысогласно существующим способам,Под единицей Ансома понимается такое количество фермента, которое при инкубировании в течение 10 мин при 25 С и рН 75 вприсутствии денатурированного гемоглобинаосвобождает из этого субстрата эквивалент1 мкг тирозина, определяемый посредствомфотометрического поглощения при 280 ммк нафильтрат, неосаждаемый трихлоруксуснойкислотой,Ферментные продукты, получаемые в соответствии с изобретением, вызывают в живоморганизме адекватную оптимизацию слизи.По сравнению с естественными ферментамиоптимизирующего действия - трипсином ихемотрипсином - их оптимизирующее действие выше, Сравнение с этими ферментамипроводят в пробирке при помощи теста наплавленной редукции. вязкости слизи (НРСВ) .Измерения.В качестве субстрата используют слизь поросенка или теленка тотчас же после забояживотного, находящегося на диете в течениесуток. Извлекают три последовательных отрезка киношок, длиной около 1 м каждый. Перевязывают один конец отрезка кишки и слабым надавливанием выделяют с другого конца поверхностную слизь, которую удаляют.Более сильным давлением или соскабливанием внутренней стенки предварительно вытянутого куска кишки выбирают глубиннуюслизь, от которой отделяют растворимую фазупри промывании в трех объемах воды с последующим центрифугированием. Собираютпримерно 50 мл нерастворимой слизи от одного животного. Эта слизь может хранитьсяв течение многих дней при температуре- 20 С или же может использоваться сразудля вискозометрических опытов.Для вискозометрических измерений используют конус-плату Брукфильда, которая позволяет работать с 1 г нерастворимой слизи. Угловая скорость подвижного конуса регули 334720 5 ю дД 20 25 зо 35 40 45 50 55 60 65 4руется преимущественно на 12 об)мин, температуру поддерживают на уровне 37 С.Шкала, градуированная от 0 до 100, позволяет определить относительную вязкость при помощи прямого считывания. При наличии только одной слизи регулятор ставят на 100, затем добавляют 0,5 мл буферного раствора при рН 7,5, содержащего изучаемый ферментный продукт. Если указанный продукт является активным, то вязкость быстро понижается, и можно зарегистрировать кривую НРВС в функции от времени, Для сравнения используют высокоочищенные ферменты, содержащие соответственно 1600 и 20000 ед,А./мг. Они вызывают редукцию вязкости, которая достигает площадки за 30 мин, а поэтому длительность теста может быть ограничена 30 мин. При концентрации 50 ед. А, на 1 г слизи они вызывают уменьшение вязкости слизи на 20 , Для концентрации 250 ед, А. на 1 г слизи уменьшение вязкости составляет 60 и 400 соответственно. Впрочем, слизь теленка или поросенка меняется от животного к животному, так что и результаты могут меняться.Имея образец слизи, определяют НРВС, вызванную 250 ед. А. изучаемого ферментного продукта на 1 г слизи, Если НРВС составляет от 40 до 600 , предпочтительно от 35 до 650 , то ферментный продукт удовлетворяет тест.На графике, иллюстрирующем действие (ферментов на слизь, кривая 1 - НРВС %ля трипсина; 2 - для хемотрипсина; 3 - для папаина (не удовлетворяет тесту НРВС по недостатку); 4 - для продукта, полученного в соответствии с изобретением (точно удовлетворяет тесту НРВС); 5 - для фермента Вас. зпы 11 Ь (не удовлетворяет тесту НРВС по избытку). Ниже даны примеры получения различных продуктов в соответствии с изобретением.Пример 1. Получение продукта А.Перебродившую среду фильтруют и концентрируют в вакууме. Получают ферментный продукт в сыром виде, содержащий не менее 50000 ед. А. на 1 мл.П р и м е р 2. Получение, продукта Б.Из продукта А при атомизации получают сырой ферментный продукт в твердом состоянии с числом не менее 100 ед, А. на 1 мг.Пример 3. Получение, продукта В, Из продукта А при помощи солевого осаждения (сульфитом аммония) и высушивания в,вакууме получают частично очищенный продукт, содержащий не менее 1000 ед.Л/мг.Пример 4. Получение продукта Г.Из продукта А прн помощи последовательных осаждений сульфатом аммония и растворений в ацетоне и последующего высушивания конечного, продукта в вакууме получают ферментный продукт средней очистки, содержащий не менее 10000 ед. А. на 1 мг, и представляющий относительную электрофоретическую монодисперсию ферментной активности, 334720Привес крыс г/сутки, оо 100 ед, А, на 1 г корма 1000 ед,А. на 1 гкорма фермент без ферментово а Х КонтрольПапаинпартия 1партия 1партия 1Вас, впЫ 111 в 0 30 40 50 60 80 2,85 100 2,85 100 3,45 121 4,15 143 3,25 114 3,00 105 2,85 100 3,46 119 4,05 142 295 103 2,40 84 50 55 60 65 Из продукта Г электрофорезом в жидкой фазе или хроматографией на колонке, диализом и лиофилизацией выделяют предоминирующий продукт с высокой очисткой, содержащий не менее 50000 ед. А, на 1 юг и имеющий абсолютную электрофоретическую моподисперсию,Все эти продукты отвечают тесту НРВС.Их пригодность для практического применения определяется нечувствительностью трипсиновым ицгибиторам, что подтверждается экспериментальным путем.Испытание на крысах. П р и м е р 1. Белых альбиносных крыс распределяют на группы по 5 самок и 5 самцов, Экспериментальные группы получают помимо стандартного корма еще дополнительно ферментные продукты из расчета 10 и 100000 ед. А. на 1 кг живого веса в сутки, что соответ. ствует 100 и 1000 ед, А. на 1 г корма. Результаты испытания приведены в таблице. Пример 2, Крысы получают корм, богатый соевыми белками.Опытная группа получает помимо кормаеще и фермент по изобретению (партия 2, 100 ед. А. на 1 г корма=100000 ед. А, на 1 кг живого веса в сутки). Привес крыс составляет как в контрольной группе, так и в опытной группе 5,25 г/сутки.В этом же опыте вторая опытная группаполучает ферментный продукт с питьевой водой из расчета 500 ед. А./лил=100000 ед.А.на 1 кг живого веса в сутки.Экспериментальная группа 2 получает туже пищу и питьевую воду, с растворенным а ней ферментом (партия 11 при дозе 500 ед.А./ /мл=100000 ед. А. на 1 кг живого веса в сутки). Средний привес крыс составляет 7,3 г в сутки.Отсутствие привеса в первой опытной группе по сравнению с контрольной группой объясняется тем, что ферментный продукт имеет слишком тонкий помол для соевых белков, которые при значительном содержании,в корме могут поглотить весь фермент, но при добавлении фермента в питьевую воду достигается частичное проникновение ферментов к слизи. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 бПример 3. Испытание на курах свобод. нопо содержания (на земле)Цыплят сначала содержат вместе на одном и том же корме. В возрасте 12 дней их разделяют на 4 группы, каждая из которых получает корм на основе кукурузы и сои при содержании белка 16%. Контрольная группа 1 (без ферментов).Опытная группа 1 получает дополнительно ферментный продукт Б (см, выше) из расчета 4 г на 1 кг корма (100 ед. А./л.г). Доза фермента составляет 400 ед. А. на 1 кг корма или 40000 ед. А. на 1 кг живого веса в сутки,Контрольная группа 2 получает корм на основе кукурузы и сои, но с нормальным содержанием белка 22/о,Опытная группа 2 получает тот же .корм, что и контрольная группа 1, но с добавлением фер ментов.В возрасте 58 дней вес птиц составляет соответственно по группам 1430, 1553, 1676 и 1772 г, и отношение веса корма к весу птицы соответственно 2,30; 2,15; 2,09 и 1,98.П р и м е р 4, Куры содержатся в клетках. Контрольная партия получает коммерческую пищу на основе сои и кукурузы, содержащей 21 % белков, 8 лиг/кг пеницилина - прокаина и 25 лкг/кг тетрациклина. Опытная партия дополнительно получает 400 лг/кг ферментного продукта В с титром 2000 ед. А./мг. Доза фермента составляет 800 ед. А, на 1 кг корма или около 800000 ед. А. на 1 кг живого веса в сутки, На 30 день опыта куры обнаруживают кажущийся одинаковым результат в обеих группах, однако в контроле каждая курица потребила 1080 г пищи, а в опытной партии - 903 г, что дает экономию около 16/На 40 день возникает эпидемия в курятнике, и на 60 день смертность составляет в контроле 5 о/ов опытной партии 1,6 о/оСредний вес составляет 1319 и 1346 г и коэффициент потребления корма - соответственно 2,63 и 2,8: Экономия - 6,5/,.Положительные результаты опытов получа 1 от также на телятах. Предмет изобретения 1. Способ получения протеолитических ферментных продуктов, предназначенных для оптимизации вязкости кишечной, бронхиальной и цервикальной слизи, включающий культивирование микроорганизма-продуцента на жидкой питательной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральных солей, при аэрации среды воздухом, а также выделение целевых продуктов из культуральной среды и их очистку, отличаюцийся тем, что, с целью получения ферментных продуктов, снижающих вязкость кишечной слизи в пределе от 35 до 65% и устойчивых к ингибиторам трипсина, в качестве микроорганизмапродуцента берут 51 гер 1 отусез 1 гайае, предпочтительно штаммы Мо 1998 и 2019 (Мцзепп 1 1 ча 11 опа 1 дНЫо 1 ге Ка 1 цге 11 е де Раг 1 з), культивирование ведут до тех пор, йока конечный титр среды не достигнет 3000 ед, Ансома на 1 мл, а полученные в результате брожения продукты при необходимости концентрируют и очищают согласно известным методам,2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культивирование Ыгер 1 огпусез гайае ведут при 28 С на жидкой питательной среде, со 334720Вдержащей 30 г соевой муки, 30 г глюкозы, 0,8 г динатрийфосфата, 10 г карбоната кальция в расчете на 1 л среды при рН среды 7,0 и аэрации воздухом из расчета 0,3 объема5 воздуха на 1 объем среды в 1 мл.3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем,что культивирование ведут в течение 60 - 84 час.Составитель М. ДранишниковРедактор А. Купрякова Техред Т, Ускова Корректор 3, ТарасовЗаказ 1573/17 Изд.481 Тираж 448 ПодписноеПНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССРМосква, Ж.35, Раушская наб., д. 4/5пография, пр. Сапунова, 2