Способ получения рестриктазы ai и i

(19) 111) ЕТЕ САНИ ТЕЛЬСТ АВТОРСКОМУ С ГОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ННТ СССР(7.1) Научно-производственное объединение "Биолар" и Всесоюзный научноисследовательский институт молекулярной биологии(56) КоЪеггз К.Ю, Муегз Р.А Могг 1- зоп А., Мцггау К.А. ЯресН).с епйопцс 1 еазе йгош АгСЬгоЪассег 1 цгецз. - Л Мо 1 ес. В 1 о 1., 1976, ч. 102, Р р. 157-165.С 1 агКе С.М., Е 1 агй 1 еу Б,С. Рцг 1 Н-саГхоп, ргореггдез апй , зресНйу оЕ где гезггсг 1 оп епйопцс 1 еазе Ггош Вас 111 цз згеагоСЪегшорМ 1 цз." Вдо" селеш, 1.,1979, ч. 177, р. 49-62.Сеогяе Л СЪгйцхап Х.С. В 1 озресИс Егасй 1 опахоп шаЕг).х Гог зев" пепсе - зресИс епс 1 опцс 1 еазез.- Нцс 1 ес АсИз Вез., 1978, ч. 5, р. 2223-2232.Сгееп Р.Л., Неупе 1 сег Н.Ь.,ег а 1. А яепега 1 шеспой Хог спе рцгЯсагоп оГ гезгг).сйоп епзушез. - Ицс 1. Ас, Вез., 198, ч. 5, И 7, р. 2373-2380. С 12 М 9/14 (С 209/С 12 К 1,06)(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕСТРИКТАЗЫ(57) Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получениярестриктазы, А 1 ц 1 иэ клеток бактерий "Аг 1 ЪгоЬасгег 1 цгецз. Целью изобретения является повышение стабильностирестриктазы А 1 ц 1 и увеличение выходацелевого продукта. Разрушение клетокпроводят в присутствии б-ного раствора яичного масла в органическомрастворителе, причем в качестве органического растворителя используют то"луол при объемных соотношениях яичного масла и толуола (1,0: 12,0)(1,0: 16,0). В результате использования предлагаемого изобретения выходрестриктаэы А 1 ц 1:составляет 10000.15000 ед/г биомассы. 2 табл, 1449582Изобретение относится к химическойцромышленности, касается способа поЙучения .рестриктазы А 1 ц 1 из клетокбактерий АгЬгоЬасег 1 цг.ецз,Цель изобретения - повышение стабильности рестриктазы А 1 ц 1 и увелиЧение выхоца целевого продукта.Способ предусматривает разруше".ние клеток в присутствии б-ногоаствора яичного масла в толуоле, вэате сохраняется 907 активности ретриктазы А 1 ц 1. При разрушении клетоколько в присутствии толуола в лиэае сохраняется 60% активности рестиктазы А 1 ц 1, т.е. в 1,5 раза меньше,ем при добавлении б-ного раствораичного масла в толуоле.Яичное масло получают из желткауриных яиц. Яичное масло имеет слеующий состав, %; липиды 60, этилоый спирт 15, вода 25. Липиды включа"т большую и крайне разнороднуюруппу веществ: лецитин, кефалин,риглицериды, холестерин и др.П р и м е р 1, 10 г биомассы Аг 1 ЪгоЬасет 1 цСецз ВКПМ, Вразмораживают и суспендируют в 20 мл рабочего буфера .(трис-НС 1, 0,01 МфН 7,2-7,6 2-меркаптоэтанол. 0,01 М).К ЗО мл суспензии добавляют 5 мл8%-ного раствора яичного масла в толуоле. Отношение яичного масла к тойуолу 1,0: 12,0. Во время разрушенияклеток температуру суспензии поддерфвают на уровне 1-2 С. Обрабатываютуспензию ультразвуком 5-10 с 2-3азамОбработанную ультразвуком микроб 1 ую массу центрифугируют на центрифуГе Нх;Ь рреей (10000 х я, 30 мин).После центрифугирования отбираютводный слой и наносят на колонку сфосфоцеллюлозой. (Ч.= 40 см), уравновешенную рабочим буфером.Фракции, содержащие рестриктазуфц 1, подвергают дальнейшей очисткес помощью колоночной хроматографиина гепарин-сефарозе.Активные фракции дналиэируют против 1 л диалиэной смеси в течение12 ч,Состав диализной смеси: глицерин 507, трис-НС 1 10 мМ, рН 7,4, КС 1 50 мМ.Выход рестриктаэы А 1 ц 1 150000 ед/ /10 мл, активность 15000 ед/мл., выход 15000 ед/г биомассы. Для измерения активности рестриктазы А 1 ц 1 используют метод электрофореэа в геле.За единицу активности рестриктазыА 1 ц 1 принимается количество фермента,достаточное для полного расщепленияо1 мкг ДНК Фага 3 эа 1 ч при 37 С.П р и м е р 2. Суспендирование10 биомассы проводят аналогично примеру 1. К 30 мл суспензии добавляют5,0 мл 7%-ного раствора яичного масла в толуоле, Отношение яичного маслак толуолу 1,0: 13,О. Дезинтеграцию15 клеток и последующее выделение рестриктаэы А 1 ц 1 проводят аналогичнопримеру .1,Выход рестриктазы А 1 ц 1 125000 ед/. П р и м е р 3. Суспендированиебиомассы проводят аналогично примеру 1, К 30 мл суспензии ;.добавляют5,0 мл 6%-ного раствора яичного масла в толуоле. Отношение яичного масла к толуолу 1,0: 16,0. Дезинтеграциюклеток и последующее выделение рестриктаэы А 1 ц 1 проводят аналогичнопримеру30Выход рестриктаэы А 1 ц 1 100000 ед//10 мл, активность 10000 ед/мл, выход 10000 ед/г биомассы.П р и м е р 4. Сусаендированиебиомассы проводят аналогично примеру 1. К 30 мл суспенэии добавляют 5,0 мл 5%-ного раствора, яичного масла в толуоле. Отношение яичного масла к толуолу 1,0:19;0Дезинтеграцию клеток и последующее выделение рестриктазы А 1 ц 1 проводят аналогичнопримеру 1.Выход рестриктазы А 1 ц 1 50000 ед//10 мл активность 5000 ед/мл, выход5000 ед/г биомассы.П р и м е р 5. Суспендированиебиомассы проводят аналогично примеру 1. К 30 мл суспензии добавляют 5 мл 9%-ного раствора яичного масла в толуоле, Отношение яичного маслак толуолу 1,0: 10,0. Дезинтеграцию клеток и последующее выделение рестриктаэы А 1 ц 1 проводят аналогично примеру 1,Выход рестриктаэы А 1 ц 1 55000 ед//10 мл, активность 5500 ед/мл, выход 5500 ед/г биомассы.П р и м е р 6, 10 г .биомассы Ат"спгоЬасйег 1 цецз ВКПМ Вразмораживают и суспендируют в 20 мл ра1449582 5О 15 20 25 30 35 40 45 50 бочего буфера (трис"НС 1 ,0,0 М, рН 7,2-7,6; 2-меркаптоэтанол 0,0 М). К 30 мл суспензии добавляют 5 мл концентрированного толуола, Во время разрушения клеток температуру суспенэии поддерживают на уровне 1-2 С Обрабатывают суспенэию ультразвуком 5-10 с 2-3 раза.Обработанную ультразвукЬм микробную массу центоифугируют на центрифуге фНх 8 Ь зреей" (10000 х я, 30 мин).После центрифугирования отбирают водный слой и наносят на колонку с фосфоцеллюлоэой (Ч = 40 см), уравновешенную рабочим буфером.Фракции, содержащие рестриктазу А 1 ц 1, подвергают дальнейшей очистке с помощью колоночной хроматографии на гепарин-сефарозе.Активные фракции диализируют против 1 л диализной смеси в течение 12 ч.Состав диализной смеси: глицерин 503, трис-НС 1 10 мМ, рН 7,4, КС 1 50 мМ.Выход рестриктазы А 1 ц 1 100000 ед/ /10 мл, активность 10000 ед/мл, выход 10000 ед/г биомассы.П р и м е р 7. Суспендирование проводят аналогично примеру 1. К 30 мп суспензии добавляют 4 мп концентрированного толуола. Дезинтеграцию клеток и последующее вьделение рестриктаэы А 1 ц 1 проводят аналогично примеру 1.Выход рестриктазы А 1 ц 1 83000 ед/ / 10 мл, активность 8300 ед/мл, выход 8300 ед/г биомассы.П р и м е р 8. Суспендирование биомассы проводят аналогично примеру 1. К 30 млсуспензии добавляют 3 мл концентрированного толуола. Дезинтеграцию клеток и последующее выделение рестриктазы А 1 ц 1 проводят .аналогично примеру 1. Выход рестриктазы А 1 ц 1 66000 ед/,6600 ед/г биомассы. Выход рестриктаэы А 1 ц 1 75000 ед/ / 10 мл, активность 7500 ед/мл, выход 7500 ед/г биомассы.В примерах 4-8 иллюстрируются запредельные значения параметров.Данные, полученные в результате вьделения рестриктазы А 1 ц 1 из штамма бактерий АгСЬгоЬасгег 1 цйецз ВКПМ Вс использованием разных способов, представлены в табл, 1,П р и м е р 10, Для вьделения ре" стриктазы А 1 ц 1 используют биомассу бактерий АгйЬгоЬасгег 1 цйецз ВКПМ В, Размораживание биомассы, дезинтеграцию клеток и вьделение фермента проводят аналогично примеру 1.Выход рестриктаэы А 1 ц 80000 ед/ /10 мл, активность 8000 ед/мл, выход 800 ед/г биомассы.П р и м е р 11. Для вьделения ре стриктазы А 1 ц 1 используют биомассу бактерий АгЬгоЪасйег 1 цецз ВКПМВ. Размораживание биомассы,дезинтеграцию клеток и вьделение фер" мента проводят аналогично примеру 1.Выход рестриктазы, А 1 ц 1 40000 ед//10 мл, активность 4000 ед/мл, выход4000 ед/г биомассы.Данные, полученные в результатевьделения рестриктазы А 1 ц 1 из разныхштаммов бактерий АггйгоЪасйег 1 цгецзс использованием различных способов,представлены в табл. 2. Из табл. 2 видно, что при выделении рестриктаэы А 1 ц 1 из разных бактериальных штаммов АгеЬгоЬасйег 1 цсецзпроисходит увеличение активности ивыхода фермента по сравнению с известным способом. Формула изобретенияСпособ получения рестриктазы А 1 ц 1, включающий разрушение клеток АгеЬгоЬасйег 1 цгецз, фракционирование полу ченного лизата и очистку целевого продукта ионообменной хроматографиейи диализом, о т л и чающий с ятем, что, с целью повышения стабильности рестриктазы А 1 ц 1 и увеличениявыхода целевого продукта, разрушениеП р и м е р 9. Суспендирование биомассы проводят аналогично примеру 1. 30 мл суспензии обрабатывают .ультразвуком 5-10 с, 2-3 раза. Последующее выделение рестриктазы А 1 ц 1 проводят аналогично примеру 1. клеток проводят в присутствии стабилизатора - 6-87.-ного раствора яичного масла в органическом растворителе, причем в качестве органического раст 55 ворителя используют толуол при объемных соотношениях яичного масла и толуола 1,0: 12,0-1,0: 16,0.1449582 Т а б л и ц а 1 Способ получения рестриктазы А 1 ц 1 Штаммпродуцент С испдльзованием толуолаи ультразвука С использованием удьтраэвука Актив- Выход, ность, ед/г ед/мл биомассы Активность, ад/мл АгеЬгоЬас 1 еГ 1 ц 1:ецаВКПМ В15000 15000 10000 10000 7500 7500 Таблицаг Способ получения А 1 ц 1, Штамм-продуцентФ С использованием С использованиемтолуола и ультра- ультразвуказвука Выход,ед/г биомассы ность, ед/мл 7500 7500 4000 4000 2000 2000 Составитель Е 1,ХодаревРедактор И.Горная ТехредЛ.Сердюкова Корректор О.Кравцова Заказ 6934/28 Тираж 520 ПодписноеВНЙИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Иосква, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Йроизводственно-полиграфическое предприятие, г Ужгород, ул. Проектная, 4 АгспгоЬасег 1 цеце ВКПМ ВА 1 йЬгоЪасгег 1 цйецв ВКПМ ВАт 1 ЬгоЬасег 1 ц" гецз ВКПМ ВС использованиемяичного масла втолуоле и ультразвука Выход,ед/г биомассыС использованиемяичного масла втолуоле и ультразвука Актив- Выход,ность, ед/г био " ед/мл массы 15000 15000 8000 8000 4000 4000 Актив- Выход, ность, ед/г ед/мл био- массы 10000 10000 5300 5300 2600 2600 Актив- Выход, ность, ед/г биоад/мл массы