Питательная среда для выращивания аrтнrовастеr luтеus продуцента рестриктазы ai и i

П р и м е р 1. Питательная среда содержит, г/л 3Белковый гидролиэатиз рыбных отходов,полученных при переработке трески 50,0 Глицерин 4,0 Вода, л До 1,0 Культуру А. 1 цгецз ВКПМпредварительно адаптируют на сухом пита 50 55 Изобретение относится к биотехнологии и касается состава питательныхсред для выращивания АггЬгоЬасгег1 цецз - продуцента рестриктаэы А 1 ц 1.Цель изобретения - повышение вы 5хода рестриктазы А 1 ц 1 и удешевлениеоцелевого продукта.Изобретение предусматривает ис.пользование белкового гидролизатаполученного из, отходов тресКи (головаи внутренности). В мозгу трескисо ержится 7"9% белка от свежей ткани, в сепезенках - 17-18%, почках -16 17%, сердце - 16"18%. Кроме того,указанные отходы богаты витаминами(В:., фолиевой кислотой, парааминобе зойной кислотой, биотином), которь необходимы для нормального разви ия бактерий,Предлагаемое техническое решениеоб спечивает повьшение выхода рест иктаэы А 1 ц 1 с 80 ед/г биомассы до10 00-15000 ед(г биомассы.Морфологически АггЬгоЬасгег 1 цгецз 25во время развития претерпевает измене ия, т.е, молодая культура имеетформу палочек, которые по мере обеднения среды питательными веществамии обогащения .продуктами метаболизмапостепенно переходят в форму кокков.Коккообразные клетки АггЬгоЬасгег1 Мецз прекращают биосинтез рестриктаэы А 1 ц 1, Введение в питательнуюсреду белкового гидролизата из рыбныхо одов способствует продлению логар мической фазы роста и предотвращает раннее старение культуры,рН белкового гидролизата иэ рыбнь 1 х отходов 7,2-7,4. При растворенииего в воде рН не меняется. Оптимальным рН для АггЬгоЪасег 1 цгецз является значение 7,2-7,4. Таким образом,отпадает необходимость при приготовлении питательной среды добавлятьр 1 слоты или щелочи, которые отрицательно влияют на биосинтез рестриктазы А 1 ц 1,тельном агаре в чашках Петри при 35 о37 С в течение 16-18 чИнокулят готовят, пересевая культуру бактериологической петлей в качалочные колбы (250 мл питательной среды данного состава в каждой) и размножают в условиях аэрации при 35-37 С в течение 14-16 ч. Посевной материал готовят иэ расчета 5% по отношению к объему питательной среды, загруженной в ферментатор.Ферментацию кулЬтуры проводят на данной питательной среде при 35-37 С, при подаче воздуха 1 объем воздуха: ;1 объем питательной среды, перемеши" вании 200-250 об/мин, Выращивают до оптической плотности суспенэии клеток 0,9-1,2 опт. ед. (ФЗК, 550 нм, кювета 0,5 см), что соответствует поздней логарифмической фазе (по калибровочной кривой).Выход биомассы 9,0 г/л культуральной жидкости.Выделение фермента можно проводить двумя методами.Метод 1, 10 г биомассы бактерийАггпгоЬасег 1 цгецз ВКПМ Вразмораживают и суспендируют в 20 млрабочего буфера (0,01 М трис-НС 1,рН. 7,2-7,6; 0,01 М 2-меркаптоэтанол),К 30 мл суспензии добавляют 5 мл8%-ного раствора яичного масла в толуоле. Отношение яичного масла к толуолу 1,0 ф 12,0, Во время разрушенияклеток температуру суспензии поддерживают на уровне 1-2 С. Обрабатываютсуспензию ультразвуком 5-10 с, 23 раза.Отработанную ультразвуком микробную массу центрифугируют на центрифуге "Нь.яЬ, зреей" (10000 х К,30 мин),После центрифугирования отбираютводный слой и наносят колонку с фосфоцеллюлозой (7 = 40 см), уравновешенную рабочим буфером.Фракции, содержащие рестриктазуА 1 ц 1, подвергают дальнейшей очисткес помощью колоночной хроматографиина гепарин-сефарозе,Активные фракции диализируют против 1 л диализной смеси в течение12 ч.Состав диализной смеси: глицерин50%, трис-НС 1 10 мМ, рН 7,4, КС 150 мМ, з 144Для определения активности рестриктазы А 1 ц 1 используют метод электрофореэа в геле.За единицу активности рестриктазы А 1 ц 1 принимают количество фермента, достаточное, для полного расщепления 1 мкг ДНК фага за 1 ч при 37 С.Выход рестриктазы А 1 ц 150000 ед/ /10 мл, активность 15000 ед/мл, выход 15000 ед/г биомассы.Метод 2. Размороженную биомассу бактерий АгЬгоЬасег 1 цСецз ВКПМ В(50 г) суспендируют в 100 мл 10 мМ трис-НС 1 буфера, рН 7,2, содержащем 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ аэид натрия, 1 мМ трилон Б (буфер А) и доводят этим же буфером до объема 150 мл. К суспензии добавляют 1,5 мл 107-ного тритона Хи 150 мг ливоцима. Лизис проводят 1 ч при постоянном перемешивании, Дальнейшее фракционирование лизата проводят в системе двухфазного разделения.Полученный лиэат добавляют к смеси, состоящей из 37,0 мл 152-ного водного раствора декстрана Т, 56 мл ЗОБ-ного ,водного раствора полиэтиленгликоля и 35 мл 4,0 М хлористого натрия (рН смеси 6,5). Тщательно перемешивают в течение 15 мин и центрифугируют на центрифуге "НхдЬ зреес 1" (20000 х я, 20 мин). Верхнюю ПЭГ-фазу объемом 120 мл, содержащую фермент, отбирают, разбавляют двукратным объемом буфера А, добавляют тритон Х(О, 1 Е) и наносят на колонку с фосфоцеллюлозой, уравновешенную буфером А, содержащим О, 1 Х-ный тритон Х(буфер Б). Фермент элюируют 0-1,0 М линейным градиентом концентрации натрия хлористого в буфере Б. Фракции, содержащие рестриктаэу А 1 ц 1, концентрируют диализом против буфера Б, содержащего 553-ный глицерин.Выход рестриктазы А 1 ц 1 525000/ /50 мл, активность 10500 ед/мл, выход рестриктазы А 1 ц 1 10500 ед/г биомассы; По данным электрофореза препарат фермента не содержит детектируемых примесей неспецифических эндонуклеаз.П р и м е р 2. Питательная среда содержит, г/л;Белковый гидролизат изрыбных отходов, полученных при переработке трески 47,5Выращивание биомассы. Адаптацию55культуры, инокуляцию посевного материала, ферментацию культуры проводятаналогично примеру 1,Выход биомассы 3,5 г/л культуральной жидкости, выход рестриктазы А 1 ц 1,Ф Глицерин 3,5Вода, л До 1,0Выращивание биомассы, Адаптацию5культуры инокуляцию посевного матеФриала, ферментацию культуры проводятаналогично примеру 1.Выход биомассы 8,0 г/л культуральной жидкости, выход рестриктазы А 1 ц 112500 ед/г биомассы, 100000 ед/лкультуральной жидкости,П р и м е р 3. Питательная средасодержит, г/л:Белковый гидролизат изрыбных отходов, полученных при переработкетрески 45,0Глицерин 3,0Вода, л До 1,0Выращивание биомассы. Адаптациюкультуры, инокуляцию посевного материала, ферментацию культуры проводятаналогично примеру 1Выход биомассы 7,0 г/л культураль"25 ной жидкости, выход рестриктазы А 1 ц 110000 ед/л биомассы, 700000 ед/лкультуральной жидкости,П р и м. е р 4.(иллюстрирует запредельные значения параметров). Питательная среда содержит, г/лБелковый гидролизат изрыбных отходов, получаемых при переработке трески 45,5Глицерин 2,5Вода, л35До 1,0Выращивание биомассы. Адаптациюкультуры, инокуляцию посевного материала, ферментацию культуры проводятаналогично примеру 1.Выход биомассы 3,0 г/л культуральной жидкости, выход,.рестриктазы А 1 ц 15500 ед/г биомассы, 16500 ед/л куль"туральной жидкости.П р и м е р 5 (иллюстрирует запре-45 дельные значения параметров). Пита"тельная среда содержит, г/л:Белковый гидролизат изрыбных отходов, полученных при переработкетрескиГлицеринВода, лБелковый гидролизат изрыбных отходов, полученных при переработкетрески2 О ГлицеринВода, л 45,0-50,0 3,0-4,0 До 1,0Таблица 1 Выход рестриктазы Питательная среда, Выход биомассы,г/л ед/л культураль ной жидкостиШта м-продуцент ед/г био- ед/л куль" массы туральнойжидкости Белковый гидролизат из рыбных отходов 45,0-50,0 АгйЬгоЬасгег 1 цгецз ВКПИ В10000- 7000015000135000 7000-8000 28000400007,0-9,0 АгдгоЬасгег 1 цгецз ВКПБ ВГлицерин 3,0-4,0Вода. до 1,0 л 4,0-5, 0 ЛгбйгоЬасгег 1 цСез ВКПИ В3000-4000 1200020000.ецз ВКПИ ВВода до 1,0 л 2,0-2, 1500-2000 3000-5000 6300-7500 23625-33750 4000-5000 8000-12500 ВНИИПИ Заказ 6934/28 Тираж 520 Подписное Произв.-полигр. пр-тие, г. ужгород, ул. Проектная, 4 145000 ед/г биомассы, 17500 ед/л культуральной жидкости,Данные выращивания штаммов - продуцентов рестриктазы А 1 ц 1 на .предлагаеМой питательной среде приведеныв твбл. 1,бранные выращивания штаммов - продуцнтов рестриктазы А 1 ц 1 на известнойпитательной среде приведены втаб, 2,з табл, 1 и 2 видно, что при выращ ванин различных штаммов - продуцен ов рестриктазы А 1 ц 1 на предлагаемой питательной среде происходит увелич ние выхода . биомассы и рестриктазпо сравнению с результатами, получ иными с использованием известнойсре ы.Формула изобретенияитательная среда для выращиванияАгг гоЪасг.ег 1 цгецз - продуцента ре 49579 6стриктазы А 1 ц 1, содержащая н качест-, ве источника углерода глицерин, источники аминного азота, витаминов, микроэлементов и воду, о т л и ч а - ю щ а я с я тем, что, с целью повышения выхода рестриктазы Л 1 ц 1 и удешевления целевого продукта, в пита-, тельную среду вводят в качестве ис точников аминного азота, витаминов имикроэлементов белковый гидролизат из рыбных отходов, полученных при переработке трески, при следующем соотношении компонентов, г/л средыф 15