Штамм бактерий bacillus suвfilis продуцент эндонуклеазы рестрикции bsu 15 i

83 27,4, После инкубации при 30 С образуют крупные, белесые колонии, выпуклой формы, слизистой консистенции. Продолжительная инкубация (2-4 суток) приводит к исчезновению слиаи, коло-нии крупные, плоские с небольшой морщинистостью. Среда используется для оживления культуры.Среда 2. Состав как у среды 1 толь. ко безагара. Среду используют для препаративного выращивания клеток,оПри 30 С и аэрации 2 объема в минуту, 200 об/мин мешалки. Мутность культуры ровная.Полученная рестриктаза Ввц 15 1 характеризуется следующими свойствами; узнает и специфически расщепляет последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК 5 -АТССАТ, оптимальное значение рН 6,5-7,5, оптимальная темопература 30-37 С. Рестриктазная активность не меняется в широком диапазоне концентраций ИаС 1 до 100 мМ.Сравнение характеристик предлагаемого штамма и известного представлено в таблице, в которой показано получение рестриктаз иэВасх 11 цв вцЬС 1 хз Ви Вас 111 цв вресхев. 14495 30ВК 1 М Вимеет следующие характеристики.Морфологические признаки, В молодо культуре (16-18 г) клетки палочкоидные размером 0,7-0,8 мкм в поперечнике и 2-3, иногда 5 мкм, в длину Располагаются одиночно, парамиил образуют цепочки. Подвижные, жгути 1 си латеральные. Образуют эндоспоры эллипгической формы, расположенные преимущественно центрально, неболее одной на клетку-спорангий, Отчетливой раздутости спорангия не наблюдается. Не образуют околосноральнь 1 х тел, грамположительные.45Физиолого-биохимические признаки.Аэробы, каталазоположительные. Прирасщеплении глюкозы образуют кислоту,но не газ. Реакция Фогес-Проскауэраположительная. Не .образуют индол,восстанавливают нитраты до нитритов,Гйдролизуют крахмал и казеин, разжижают желатину,Культуральные признаки. Хорошорастут на обычных питательных средахОПА, МПБ). Оптимальная температурао орста 37 С, но растут и при 50 С.Среда 1: агар 15 г/л, гидролизаткйльки 40 г/л, ИаС 1 20 г/л, рН 7,2 Гидролиэат кЮлькн 40 г/л, ИаС 120 г/л Бульон Хоттингера или среда, приготовленная на основе кровезамени- теля Параметры Осаждение в стрептомицинсульфате и далее: сульфатаммонийное осаждение, хроматография на оранжевой сефарозе, Фосфоцеллюлозе Р, гепаринсефарозе Хромато"графия набиогелеА - 0,5 м,целлюлозеДЕ)ФосфоцеллюлозеРЭтапыочистки 12000. Выход,ед/г 300000 1 зобретение относится к микробиолопи и представляет собой штамм, кой торй можно использовать для получения эндонуклеаэы рестрикции .(рестрик 5 тазы), узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5-АТССАТ" 3составе двухцепочечной ДНК.Йель изобретения - получение штамма продуцирующего рестриктазу задан ной специфичности с высоким выходом, быс ро растущего на обычных питательных средах.тамм продуцирует рестриктазу, наз анную,Ввц 15 1, обладающую способ остью узнаватьи расщеплять послед вательность нуклеотидов 5 ССАТ. Глубинное культивировао ние проводят при 30 С и аэрации -объема в минуту на питательной ср е, содержащей, г/л воды гидроли ат кильки 40, ИаС 1 20 до достиже я форы замедления роста. ВМход ре триктазы 300000 единиц на грамм би массы, 25Используемый штамм В. вцЫ 1 Ы (15) ВК 1 М Вполучен в результате целенаправленного поиска штаммов - продуйентов рестриктаз,;Штамм ВасП 1 цв вцЬ 11 ь.в (15",П р и м е р 1. Получение рестриктазы Ввц 15 1.Штамм В. вцЬСх 1 ьв (15) поддерживают в пробирках на агаризованной среде под вазелиновым маслом. Для оживления штамм пересевают на чашки Петри с агаризованной средой; содержащей, г/л: гидроливат кильки 40, БаС 1 20 (среда 1), агар 15, и инкубируют при 37 С в течение суток. Выросшие клетформула изобретения Штамм бактерий Вас 11 цз зцЬй 11 зВКПМ В- продуцент эндонуклеазырестрикции Взц 15 1. Составитель Н.ХодаревТехред Л,Сердюкова Корректор Э,Лончакова Редактор И.Горная Заказ 6934/28 Тираж 520 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и .открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 3 14495ки переносят в жидкую среду 1. Инокулят выращивают в термостатированнойкачалке при 37 С, 200 об/мин в течение ночи. Полученный инокулят вновят5в ферментер и выращивание проводятпри тех же условиях с аэрацией 2 объема в минуту в питательной среде 1до достижения ранней стационарнай фа"зы роста. Культуральную жидкость охлаждают и клетки осаждают центрифугированием.30 г сырой биомассы В. зцЪСПз(15) суспендируют.в 80 мл 50 мМ трис-НС 1, рН 7,5. Клетки разрушают ультразвуком ("МБЕ" США), Клеточный дебрисудаляют центрифугированием. Супернатант наносят на колонку с биогелемА - 0,5 м, предварительно уравновешенную буфером А (11 аС 1 0,8 И; ТритонХ:О, 1 , КН РО 4 20 мИ, рН 7,5,ЭДТА 0,5 мМ, 2-меркаптоэтанол 0,.1 мм,Фракции элюируют тем же буфером итестируют на наличие рестриктазыойактивности по способности специфически расщеплять ДНК фагапри инкубировании н буфере: трис-НС 1 20 мИ,рН 7 ф 5 е ИВС 1 й 10 мМ, ЮаС 1 50 мМ,2-меркаптоэтанол 10 мМ при 37 С.Фракции, содержащие рестриктазную ак- З 0тивность, объединяют и диализуют против буфера В .(КНР 04 20 мИ, рН 7,5,ЭДТА 0,5 мИ, 2-меркаптоэтанол О, 1 мИ),Выпавший осадок удаляют центрифугированием, а супернатант,наносят наколонку с целлюлозой ДЕ, уравнове 35шенную буфером В. Велки элюируют0-1.М градиентом ЮаС 1, фракции объемом 10 мл анализируют на рестриктаз 834ную активность. Отобранные фракции объединяют и диализуют против буфера В, Градиентную хроматографию проводят аналогично предыдущей. Пробы обладающие рестриктазной активностью,о объединяют и хранят при -20 С в буфере В с 50 .-ным глицерином.Получено 10 мл препарата Взц 15 1 с активностью более 500 ед/мкл, т.е.300000 единиц на грамм сырой биомассы.Рестриктаза стабильно хранится в течение месяца.П р и м е р.2. Определение активности рестриктазы Взц 15,1.Фермент инкубируют 60 мин при 37 С в 40 мкл смеси: ДНК фага % 1 мкг, трис-НС 1 0,1 М, рН 7,0 р МаС 1 0,05 И; МяС 1 0,01 Г 1. Затем проводят электрофорез в 0,7 .-ном агарозйом геле. За единицу активности берут количество фермента для полного специфического расщепления 1 мкг ДНК фага Я в течение 1 ч.Таким образом, в соответствий с предлагаемым изобрегением получен и охарактеризован высокоэффективный штамм - продуцент рестриктазы, обеспечивающий повышенную продукцию фермента, превышающую в 25 раз продукцию известного штамма.