Штамм бактерий bacillus sтеаrотнеrморнilus продуцент рестриктазы bss ti

(51) ИИНЗИМруцтцгю ргу 1 рЬ.31 ИОТЕЗИ ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН АВТОРСКОМ ИДЕТЕЛ ЬСТВУ В А С 10 3ОДУЦЕНТ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Научно-исследовательский и конструкторско-технологический институтбиологически активных веществ Научнопроизводственного объединения "Вектор"72) Г.Д.Серов, Т.А.Терещенко, Л,И.Пучкова,Н.И.Речкунова и С.Х.Дегтярев(53) 577.15 (088.8)356) КОЬегсз Й,Т. Везтг 3 сбрпз епгувез апст)е 1 г 3 зозсЫговегз, - йис 1. Ассз Вез., 1988,ч. 16, р, 271 - 313.Мзе К. апс йаса)3 ва К. РцгИ 1 сат 1 оп оФ апеа гезтг 1 ст 1 оп епс 3 оп 1)сеазе, Зту 1, 1 говЕзс)ег 1 сЫа со 1 сагге)1 п 9 Ьзс в 3 празв 3 с 3, -Зепе, 1985, ч. 33, р. 357-361,(54) ШТАММ БАКТЕРИЙЗТЕАВОТН ЕВМОРНЫЯ - ПРРЕСТРИКТАЗЫ ВМ Т Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, в частности к обнаружению микроорганизма, способного синтезировать сайт-специфическую рестриктазу,узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов СС (А/Т)3 А/Т)06 и названную Взз Т 1.Целью изобретения является выявление штамма продуцента Вас цз зсеагойегворЫЬз, обеспечивающего получение рестриктазы Взз Т с более высокимВЫХОДОМ.Штамм бак 3 получен в резул(54) Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Целью изобретения является выявление штаммапродуцента Вас 13 оз зтеагойегвор 1131 оз, обеспечивающего получение рестриктазы Взз Т 3 с более высоким выходом. Штамм получен в результате поиска продуцентов рестриктаз среди почвенных микроорганизмов, растет на простой дешевой питательной среде, непатогенен. Из 1 г влажной биомассы выделяют 10000 ед. фермента с активностью 10000 ед/мл, Штамм Вас 1 цз зтеагойегворЫцз (360) ВКПМ В продуцирует рестриктазу Взз Т 3, имеющую сайт узнавания СС(А/Т) (А/Т)66, идентичный сайту узнавания Зту, и может заменить Яту 3 во всех генноинженерных работах,экстремальных условиях культивирования (68 - 70 С) и родуцентов рестриктаз среди почвенных микроорганизмов.Штамм депонирован в ВКПМ ВНИИ генегики под редакционным номером В(коллекционный номер депозитора 360), а продуцируемая им зндонуклеаза рестрикции названа Взз Т 1,Морфолого-культуральные признаки, Клетки, выращенные в жидкой питательной среде, представляюттонкие, с закругленны- ми концами грамположительные подвижные палочки, одиночные или в коротких цепочках, Размер клеток 3 - 4 0,5 - 1,0 мкм, 1686000Через 18-24 ч на плотной крахмала-аммиачной среде клетки образуют терминально расположенные овальные споры, расширяющие ее тело, На рыбном питательном агаре - плоские округлые с неровным краем беспигментные колонии, 2,0 - 2,5 мм в диаметре, легко снимаются бактериологической петлей, Водорастворимый пигмент в среде не обнаружен.Строгий аэроб, Клетки в жидкой среде растут диффузно, без образования пленки и осадка, Температурные границы роста 40 - 70 С. Растет в присутствии 5% хлористого натрия, при 10 - не растет. Рост отсутствует также в средах с 0,001 лизоцима и 0,020 азида натрия. Тесты на каталазу и оксидаэу положительные, на индол, сероводород и ацетоин отрицательные. Восстанавливает нитраты, синтезирует щелочную фосфатазу. Усваивает глюкозу и галактозу с образованием кислоты. Не ферментирует арабинозу, лактозу, сахарозу, ксилозу, маннит и глицерин.Штамм чувствителен к пенициллину, ампициллину, мономицину, тетрациклину, стрептомицину, леаомицетину, оксациллину, карбеницилину, гентамицину, устойчив к налидиксовой кислоте. Штамм не патогенен.Культивирование проводят в питательной среде, содержащей 1;4 бактотриптона, 0,50 дрожжевого экстракта, 1% натрия хлористого, рН 7,0 в колбах на качалке со скоростью перемешивания 200 - 250 об/мин при 68 - 70 С. Выход биомассы 3,0 - 3,5 г влажных клеток на 1 л среды, Выход фермента Взз Т не менее 10000 ед, акт,/г влажной биомассы.Полученная рестриктаза Взз Т характеризуется следующими свойствами; узнает и специфически расщепляет последовательность нуклеотидов СС(А/Т)(А/Т)86, оптимальное значение рН для действия рестриктазы 7,5 - 8,0, оптимальная температура действия 50-55 С, оптимальная концентрация МаС 50 мМ.Определяющие отличия предлагаемого штамма В. зееагойегаорЫцз (360) В: высокое содержание рестриктазы Взз Т 1, составляющей 10000 ед.акт./г влажной биомассы (в 5 раз выше), отсутствие патогенности штамма, использование для культивирования микроорганизмов простой дешевой среды.П р и м е р 1. Получение биомассы.Клетки В. з 1 еагойепворЫЬз (360), хранящиеся под слоем вазелинового масла при 40 С, высевают на скошенный питательный агар и инкубируют при 68-70 С в течение 18 ч. Затем клетки вносят в колбу с 50 мл жидкой питательной среды и выращиваютинокулят на качалке со скоростью вращения 200 - 250 об/мин при 68-70 С 18-20 ч. Полученную культуру из расчета 5-100 используют для засева 250 мл среды, содержащей1% бактотриптона, 0,50 дрожжевого экстракта. 1 натрия хлористого, Дальнейшеекультивирование проводят 16-18 ч на качалке в этих же условиях. Биомассу собирают10 центрифугированием а течение 30 мин при5000 об/мин на центрифуге "М 1 мга",Выход сырой биомассы 3,5 г/л культурал ьной жидкости.П р и м е р 2. Выделение и очистка15 рестриктазы Взз Т 1,10 г клеток суспендируют а 30 мг 0,02 Мтрис-НС буфера, рН 7,5, содержащего1 х 10 МР-меркаптоэтанола и 0,1% тритойаХ, разрушают на ультразвуковом дезин 20 теграторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием и надосадочную жидкостьнаносят на колонку с биогелем А,5 М объемом 500 мл, уравновешенную 0,02 М калийфосфатным буфером, содержащим 1 х 10 М25 Р-меркаптоэтанола, 5 х 10 М ЭДТА, 0,8 МйаС 1, 0,1% тритона Х(буфер А), Фермент элюируют тем же буфером со скоростью 20 мл/ч. Фракции. объемом 10 млсобирают и анализируют на присутствие30 фермента. Фракции, содержащие ректриктазную активность, объединяют и диализуют против 2 л 0,02 М калий-фосфатногобуфера, рН 7,5, содержащего 1 х 10 М фмеркаптоэтанола и 5 х 10 М ЭДТА(буфер В),35 меняя буфер дважды. Диализат наносят наколонку объемом 50 мл с ДЕАЕ-целлюлозой,уравновешенную буфером В. Колонку промывают буфером В и адсорбироаанный фермент элюируют 500 мл градиента ИаС40 (0,1-0 М) а буфере В, Колонку промываютбуфером В и адсорбированный ферментэлюируют 500 мл градиента. МаС (0,1 - ОМ) вбуфере В. Фракции, элюированные при0,40 - 0,55 М йаС 1, содержащие рестриктазу,45 объединяют и диализуют против 2 л буфераВ, меняя егодаажды, Фермент последиализа наносят на колонку с фосфоцеллюлозойРобъемом 20 мл, уравновешенную буфером В. Элюацию фермента проводят 300 мл50 градиента йаС (0-1,ОМ) в буфере В. Фракции, содержащие максимальную активностьрестриктаэы, элюируемые при 0,66-0,7 МЙаС 1, объединяют и диализуют против буфера В, содержащего 0,1 М ЛаС и 50% глице 55 рина,За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимого для полного расщепления 1 мкг ДНКфага Л в течение 1 ч при 50 С, Ферментный186000 препарат хранится при -20 С, Выход фермента 10000 ед./г биомассы, активность10000 ед,/мл. Составитель И.ПриваловаРедактор И.Шмакова Техред М.Моргентал Корректор Т.Палий Заказ 3576 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Взз Т 1, проводят гидролиз ДНК фага рестриктазами Взз Т и Эту по отдельности, а также совместный гидролиз этими рестриктазами. Наблюдаемая картина полного совпадения фрагментов, полученных при гидролизе ДНК рестриктазами Взз Т 1 и Ясупорознь и совместно, указывает на то, что рестриктаза В з з Т является изомером Зсу 1, узнает и расщепляет последовательность СС(А/Т)(А/Т)66.,Полученный штамм обладает следующими преимуществами по сравнению с известным; растет на более доступной,дешевой среде без антибиотиков, обеспе 5 чивает повышенный выход рестриктазыВзз Т 1.Поскольку рестриктаза Взз Т 1 имеетсайт узнавания СС(А/Т)(А/Т)66, идентичный сайту узнавания Бту, она может заме 10 нить Яту 1 в экспериментах по фрагментацииДНКА по этим сайтам,Формула изобретения Щ.тамм бактерий Вас 11 цз зсеаго ФеппорЬиз ВКПМ В- продуцент рестриктазы ВЯЗ Т 1.