Способ получения лизил-трнк-синтетазы

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 4 5114 С 12 Н 9/ НИЯ ОПИСА ЗОБ ЬСТВУ 3745994/28-1329,05,8430,04.87. Бюл,Ордена Трудовогинститут биохими( т о ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ТОРСКОМУСВИД дина(56) Батурина И.Д, Лизил-тРНК-синтетаза из Е.со 11 В: Выделение и свойст ва двух энзиматически активных форм. Украинский биохимический журнал, 1972, 44, . 3, 338-349.С.7,0 ап 8 ег а 1. РЬуз 1 са 1 апд В 1 осЬетпдса 1 СЬагасгег 1 яагдоп оГ а Риг 1- Е 1 ей Аг 8 дпу 1-гРНА-яупгЬесазе-Ьуяу 1- гВЗА БупгЬегаяе Сощр 1 ех йгощ Наг. Ьдчег "В 1 осЬещ"., 1982 21, п.8, р 1959-1966.Б Л, Мс 1 щап, О. Б. Во 11. 0 ИЕегепс 1 а 1 рпгН 1 сасдоп оХ щегЬоп 1 пе сна-яупгЬесазе апй 1 уяже-гВЯА- зупгЬегазе 2 гощ гаЬЬдс 11 чег., "В,В.Вез, Сощщцп.", 1977, 78, п. 4, р. 1191-1198.54) (57) 1. СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИИ ЛИЗИЛРНК-СИНТЕТАЗЫ из сырья животного пр исхождения, включающий гомогенизацию ткани, центрифугирование, диализ, хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе с элюцией фермента раствором КС в буфере,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повьппения выхода фермен та и упрощения способа, в качестве исходного сырья используют мьппечную ткань кролика, которую при гомогенизации обрабатывают 4-5 мМ раствором аденозин-фосфорной кислоты в фосфатном буфере рН 6,9-7,1, надосадочную жидкость диализируют против фосфатного буфера, а при хроматографии колонку промывают последовательно 0,02 М и 0,05-0,07 М раствором КС в 0,025 М трис-НС буфере, рН 7,4- 7,6, и затем элюируют целевой продукт О, 09-0, 1 М раствором КС 1 в указанном трис-НС буфере.2. Способ по п, 1, о т л и ч аю щ и й с я тем, что используют фосФатный буфер, содержащий 10 мМ КН РО+, 25 мИ КС 1, 5 мМ (СНСОО) М 8, 1,0 мМ дитиотреитола, 1,0 М глицерина,3, Способ. по п, 1, о й с я тем, что исп буфер, содержащий 1 мИ дитиотреитола, 21 19564 1Изобретение относится к областибиохимии, в частности к способам получения ферментов - аминоацил-тРНКсинтетаз, которые могут найти применение в молекулярной и физико"химической биологии при изучении процессов биосинтеза белка в тканях животныхЦелью изобретения является повьппение выхода фермента и упрощение способа,Способ осуществляют следующим образом.Проводят гомогенизацию животногосырья (мышечной ткани кролика), центрифугирование, диализ, хроматографиюна ДЕАЕ-целлюлозе с элюцией растворомКС в буфере. Мьппечную ткань кроликапри гомогенизации обрабатывают 4-5 мМАТФ, растворенной в фосфатном буфере 20(буфер А), содержащем 10 мМ КНРО ,25 мМ КС, 5 мМ (СНзСОО)Мр, 1 мМдитиотреитола, 1,0 М глицерина, рН6,9-7,1. Надосадочную жидкость диализируют против указанного буфера, апри хроматографии колонку промьваютпоследовательно 0,02 М и 0,05- 0,07 Мраствором КС в 0,025 М трис-НС 1 буфере рН 7,4-7,6 (буфер Б), содержащем10 мМ МС 1, 0,1 мМ дитиотреитола, 302,0 М глицерина, и элюируют целевойпродукт 0,09-0,1 М раствором КС 1 вуказанном трис-НСбуфере.На фиг. 1 представлена хроматограмма надосадочной (пострибосомальной) жидкости на ДЕАЕ целлюлозе, где- оптическая плотность (при длиневолны 280 нм), которая отражает количественный выход лизил-тРНК-синтетазы 2 - удельная активность целевого 40фермента.На фиг, 2 представлена электрофореграмма фермента лизил-тРНК-синтетазы в полиакриламидном геле в присутствии 0,17 додецилсульфата натрия, 45. П р и м е р 1. 200 г измельченныхмьппц кролика гомогенизируют с 400 млбуфера А, в который добавляют 4 мМАТР, Гомогенат процеживают черезткань и центрифугируют 20 мин при 5012 000 я. Надосадочную жидкость подвергают центрифугированию (центрифуга ЧАК) при 140 000 я в течение60 мин. Полученную прозрачную пострибосомальную фракцию диалиэируют в 55течение 18 ч против 2 л буфера А, Диализ проводят в целлофановых мешочкахна магнитной мешалке. Раствор последиализа в объеме 210 мл, содержащий 9- г6,1 г белка с активностью по С-лизину 3,6 пмоль, наносят на колонкуразмером 35 4 см, заполненную ДЕАЕцеллюлозой (отечественного производства), которую уравновешивают буфе-ром Б, рН 7,4. Колонку последовательно промывают 0,02 М КС 1, растворенным в буфере Б (1450 мл) со скоростью40 мл/ч, затем 0,05 М КС 1 в том жебуфере (1500 мл) со скоростью 50 мл/ч,Затем осуществляют элюцию целевогофермента с помощью О, 1 М КСв буфере Б, в результате чего получают фракцию в объеме 80 мл, содержащую 10 мгбелка с активностью по С-лизину1092 пмоль. Выход целевого ферментализил-тРНК-синтетазы составляет 497.со степенью очистки 303 раза.П р и м е р 2. 200 г измельченныхмышц кролика гомогенизируют с 400 млбуфера А, рН 7,0, содержащего 4 мМАТР. Получение пострибосомальной (надосадочной) фракции и ее диализ осуществляют, как в примере 1.Диализат в объеме 200 мл с содержанием 6,4 г белка и удельной активностью по "фС-лизину 4,6 пмоль наносят на колонку размером 425 см, заполненную микрогранулированной Ватман ДЭДЕАЕ-целлюлозой (Англия),уравновешенную буфером Б, рН 7,5.Колонку промывают 1200 мл 0,02 МКС в буфере Б со скоростью 40 мл/чдо контрольной экстинкции (Е=280 нм)меньше 0,1, затем 0,06 М КС в вышеуказанном буфере, объем 1350 мл, соскоростью 50 мл/ч, после чего проводят элюирование целевого ферментабуфером Б, содержащим О, 1 М КС 1, получают фракцию в объеме 100 мл, со"держащую 15 мг белка с удельнойактивностью по фС-лизину 1390 пмоль.Выход фермента 677, очистка 300 раэ.П р и м е р 3. 200 г измельченныхмьппц кролика гомогенизируют с 400 млбуфера А, рН 7,1, содержащего 5 мМАТФ, Получение надосадочной,пострибосомальной жидкости и диализ осуществляют, как в примере 1,200 мл диалиэата, содержащего 4,4 мг белка с удельной активностью по "4 С-лизину 4,6 пмоль, наносят на колонку размером 4 20 см, заполненную ДЕАЕ-целлюлозой фирмы "Реанал" (Венгрия), уравновешенную буфером Б, рН 7,6. Колонку промьвают 1200 мл 0,02 М КС 1 в буфере Б со скоростью 40 мл/ч, затем 1350 мл 0,07 М КС в(степеньочистки) Условия операции 2 мИ АТР 4 мИ АТР 5 мИ АТР 6 мИ АТР Заявлено 300 60 280 280 Не влияет на повышение выхода и качество очист" ки при одновременномперерасходе АТР вышеуказанном буфере. Элюирование целевого фермента осуществляют 0,09 МКС 1 в буфере Б, получают фракцию вобъеме 80 мл, содержащую 9 мг белкас удельной активностью 1280 пмоль. 5Выход 567, степень очистки 280 раз.Выбор заявленных в формуле режимовпоясняется при сопоставлении выходаи гомогенности целевого фермента взависимости от концентрации раствораАТР (граничные и запредельные значения) при гомогенизации - в табл. 1,от концентрации раствора КС 1 (граничные и запредельные значения) при последовательной промывке и элюции - втабл. 2,Для проверки чистоты фермента, получаемого согласно заявляемому способу, были использованы электрофорети ческий и ферментативный методы.Результаты проведенного электрофореза целевого фермента, полученного в примерах 1-3, в полиакриламидном геле в присутствии О, 13 додецилсульФата натрия показали, что очищенный Фермент гомогенен, о чем свидетель-. ствует электрофореграмма при разных концентрациях фермента (электрофоре- о грамма фиг. 2). Во всех препаратах целевого фермента отсутствует активность метионил-тРНК-синтетазы, с которой наиболее вероятно образование комплекса в мышечной ткани, Инкубация фермента с избытком немеченого лизина и меченым белковым гидролизатом хлореллы не привела к включению метки, что свидетельствует об отсутствии других аминоацил-тРНК-синтетаз в полученном целевом продукте.При использовании предлагаемого способа достигается положительный эфФект, которыи по сравнению с известными методами выражается в повышении выхода конечного продукта; 50-677 це. левого фермента в отличие от 5-157 по способу-прототипу; в упрощении способа за счет уменьшения количества операций хроматографии вдвое и сокращения времени, в частности в заявляемом способе проводят 4 операции за 63-67 ч в сравнении со способом-прототипом - 10 операций за 118-128 ч или со способом-аналогом " 14 операций за 150-180 ч, в расширении источников сырья - Фермент лизил-тРНК-синтетаза впервые выделен из мьппечной ткани кроликов, в получении высоко- очищенного препарата со степенью очистки в 300 раз,1195649 Таблица 2 Вьгход, % Промывка и элюированиепри хромотографии Примечание Гомогенность промывкаЗаявлено 56 0,02 М КС 1 0,03 М КС фермент гомогенен 50 11 промывка 0,04 М КС 50 ферментгененфермент гетерогенностьза счет примесейнебелковых венегомо 0,05 М КС Заявлен 0,07 М КС67 гомогенен ществфермент гомогенен 30 30 ЭлюцияЗаявлено 67 фермент гомогенен фермент гомогенен гетерогенностьза счет другихАРС-аз фермент гетерогенен 62 Редактор П.ГорьковаЗаказ 1649/3 Корректор С,Шекмар ехред И.Попов Тираж 500Государственного комитета СССРделам изобретений и открытийМосква, Ж, Раушская наб д одписно ВНИИП 130 изводственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул,Проектная,0908 М КС 1 0,08 М КС 0,09 М КС 0,1 М КС0,11 С КС фермент гомогенен удлиняется время промывки фермент гомогенен уменьшение выхода фермент гомогенен уменьшение выхода