Штамм ( ) n71 и способ получения ларвицидного препарата на его основе

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК А ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЙОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(56) Кандыбин Н.В. и др Бактокулицид - эФфективное биологическое средство борьбы с комарами, В кн,; Современные направления медицинскойрезинсекции и дератизации. Тез.докл.М., 1981, с. 63-64.Авторское свидетельство СССРВ 378408, кл. А 01 И 63/00 (прототип)(Н) В 71 И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛАРВИ,ЦИДНОГО ПРЕПАРАТА НА ЕГО ОСНОВЕ (57) 1. Штамм Вас 11 цз гйцг 1 препзя (Н) М 7 1 (коллекция ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии) продуцент ларвицидного токсина.2. Способ получения ларвицидного препарата на основе штамма Вас 1 Пця гЬцгп 8 епзя, включающий его глубинное культивирование и высушивание культуральной жидкости, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода и ларвицидной активности препарата, в качестве штамма используют Вас 3.11 ця гЬцгдп 81 епяхз (Н) В 71, который выращивают на дрожжеполисахаридной среде, культуральную жидкость концентрируют путем сепарирования, С к концентрату добавляют хлористый натИ рий в количестве 35-407 к содержанию сухих веществ в концентрате и полученную смесь высушивают пу 1 тем распыли- ,тельной сушки.1 11350Изобретение относится к микробиологическим средствам борьбы с кровососущими комарами и представляет собой новый штамм Вас 11 цз гЬцгхп 81 епз 1 я 14-го серотипа (Нн), предназначенный для изготовления бактериального препарата бактокулицида, и способуполучения такого препарата.Известен штамм Вас 111 ця гЬцг 1 п 8 епядя (Н ) 266/2 из коллекции ССЕВ 10(ЧССР).Этот штамм не обладает стабильностью и при хранении диссоциирует с образованием гладких и шероховатых вариантов с пониженной продуктивностью, 15причем гладкие варианты полностью лишены вирулентности, а также спонтаннопродуцируют вирулентный фаг в культуре.Известен также ряд способов производства энтомопатогенных препаратовна основе Вас 111 ця гЬцг 1 п 8 депяыТак, например, известен способпроизводства препарата энтобактеринапутем глубинного выращивания продуцента в течение 30-35 ч на жидкой питательной среде с аэрацией при 29-31 Сс высушиванием микробной массы вместес культуральной жидкостью при 115 -118 С и последующей стандартизации30препарата путем добавления наполнителя,Однако указанный способ не позволяет получать препарат с титром выше30-40 млрд, спор в 1 кг. 35Цель изобретения - повышение выхода и вирулентности препарата на основе Вас 111 ця г 1 шгпу.епяхя.Для достижения цели предлагаютсяштамм Вас 111 ця гЬцг 1 пфепя 1 я (Н) В 71 40(коллекция ВНИИ сельскохозяйственноймикробиологии) продуцент ларвицндного токсина, и способ получения ларвицидного препарата на основе Вас 111 цз гЬцгдп 8 хепядя, включающий глубинное культивирование бактерий и высушивание культуральной жидкости, отличающийся тем, что с целью повышениявыхода и ларвицидной активности препарата, в качестве штамма используют 50Вас 111 цз гЬцгп 81 епя 1 я (Н) В 71, который выращивают на дрожжеполисахаридной среде, культуральную жидкостьконцентрируют путем сепарирования, кконцентрату добавляют хлористый натрий в количестве 35-403 к содержаниюсухих веществ в концентрате и полученную смесь высушивают путем распылительной сушки,24 2ШтаммФ 71 представляет собой грамположительные палочки активно подвижные, длина 2,9-3,8, ширина 0,9- 1,1 мкм, споруляция начинается через 36-48 ч, При этом образуются субтерминальные споры эллиптической формы диаметром 0,9-1,1 мкм и параспоральные включения неправильной формы и неодинаковые по размеру:, 0,5 х 0,4 1,4 х 1,2 мкм.Культурально-физиологические признаки.На мясо-пептонном агаре (МПА) через 5 сут инкубации при .26 С образует средней величины колонии диаметром 1,2-1,8 см, с волнистым слегка опущенным краем, матовой мелкошероховатой поверхностью по краям и блестящей к центру колонии. Цвет серовато-бекевый или с розоватым оттенком. Посев штрихом. Через5 сут инкубации при 26 зС на МПА культура растет обильно, край мелкозубчатый, неровный, поверхность матовая,в центре штриха - мелкошероховатая,консистенция вязкая. Окраска питательной среды не меняется.Посев уколом. Рост по уколу наМПА корневидный по всей длине и поверхности.На мясо-пептонном бульоне (МПБ)через сутки инкубации при 26 С образует поверхностную пленку и помутнение среды, на 5-е сутки - осадок белого цвета.Отношение к углеводам. Сбраживаетс образованием кислоты глюкозу, мальтозу, глицерин, крахмал, маннозу,трегалоэу. Не сбраживает сахарозу,лактозу, арабинозу, ксилоэу, галактозу, рамнозу, рафинозу, левулезу, сорбит, дульцит, маннит, салицин,Гидролизует крахмал, разжижаетжелатину, молоко пептонизирует.Антигенные свойства - относитсяк Н - серотипу.Антагонистические свойства - непроявлялись по отношению к культурамВас 111 ця гйцг 1 п 8 депя 1 я других серотипов (Н Н ),Патогенные свойства.Обладает высокой токсичностью дляличинок комаров.Хранить штамм рекомендуется в виде лиофильно-высушенной культуры встерильных запаянных ампулах прн 46 С или в кристаллах хлористого нат1135024в обыч 3рия в стерильных пробиркахных условиях,Производственные показатели штамма - прототипа и предлагаемого штамма сранивались при выращивании ихглубинным методом на дрожжеполисахаридной среде.Данные приведены в табл. 1 и 2.Продуктивность штаммов (млрд,спор/мл культ. жидкости). ЮКак показывает таблица, предлагаемый штамм 71 в 3 с лишним раза продуктивнее штамма-прототипа 266/2,Титр спор и кристаллов.в готовомпродукте, полученном на основе предложенного и применявшегося ранеештаммов, приведен в табл, 2,Как показывает таблица, использование предлагаемого штамма позволяетполучить препарат, в котором титр 20спор выше, чем в случае использования штамма - прототипа почти в 3 раза,Определение ларвицидной активности готовых препаратов, полученных1) с использованием штамма-прототипа 25и 2) с использованием предложенныхштамма и способа получения препаратана его основе, показало, что в пер-.вом случае доза ЛК для личинок 4-говозраста комара Аецея аеяург 1 составила 0,29 мг/л, а во втором - 0,12 мг/л,.и следовательно, изобретение даетвоэможность повысить ларвицидную активность препарата в 2,5 раза.Пример осуществления изобретения.Штамм (Н) 71 выращивают в.пробирках поверхностным методом на МПА втечение 7 сут при 28 С.Полученную культуру используют длязасева колб с жидкой питательной сре дой следующего состава, Е: дрожжисухие кормовые 2,0; мука кукурузная1,5; вода водопроводная остальноьрН среды 7,0-7,2. Культуру в колбахвыращивают на качалке (200-280 об/мин 5в течение 72 ч при 28-30 С до полнбгоспорообразования и используют ее вкачестве посевного материала.Для получения ларвицидного препарата культуру выращивают глубинным 50методом на ферментационной среде состава, Х: 4Дрожжи сухие кормовые 2,0 Мука кукурузная 1,5 Вода водопроводная Остальное рН среды 7,0-7,2Культивирование осуществляют при 28-30 С при постоянном перемешивании и аэрации среды. Длительность ферментации 35-40. ч,После окончания ферментации культуральную жидкость, содержащую опоры и кристаллы эндотоксина ВасдПця гЬцгп 81 ейяхя (Н ), а,также остатки питательной среды подвергают концентрированию методом сепарирования. К полученному концентрату культу- ральной жидкости перед высушиванием добавляют хлористый натрий в количестве 35-407 (в расчете на содержание сухих веществ в концентрированной культуральной жидкости) и высушивают в распылительной сушильной установке при следующих условиях: температура сушильного агента на входе в сушильную башню 130-140, на выходе 70-75 С.Полученный сухой продукт, содержащий .споры и кристаллы эндотоксина Вас 111 ця еЬцг 1 п 8 хепя 1 я (Н, используют в качестве.ларвицидного средства для борьбы с кровососущими комарами,Полученный препарат имеет следующий состав, мас,Х:Спорокристаллическийкомплекс 15-16Остатки питательной среды 45-49 Наполнитель (хлористый натрий) 35-40 Использование предлагаемого высокопродуктивного штамма Вас 111 ця гЬцггп 8 депя 1 я 71 и способа получения на его основе препарата, в особенности введения хорошо растворимого в воде наполнителя (хлористый натрий), позволяет получить после высушивания мелкодисперсный хорошо растворимый высококонцентрированный порошок бактокулицида, превосходящий по свонм показателям, как было показано ранее, известные препараты в 2,5-3 раза.1135024 Таблица 1 Номер штаммапродуцента Средняя Достоверность разницы 2-х вариантовОшибкасреднейд" разностьсредних9-9," П 266/2 (ССЕВ) 0,87;0,81; 0,820,78 0,045 1,91 О, 115 16,61 2,72;2,68 2,73 0,106 Т а б л и ц а,2 Титр спор и кристаллов в готовом продукте (млрд/л) Достоверность разницы 2-х вариантов Номер штамма- продуцента ошибкаразностишО разностьсреднихУ-У= Р1 0пд) 266/2 (ССЕВ) 25,0 34,8 33, 1 8,10 1,109 61,1 39,4 Различия,71 (ВНИИСХИ) 106,0 97,5 88,5 94,2 7,5789,0 89,8 Редактор Л.Письман Корректор И.йароши Техред И.Попович Тираж 630 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Иосква, Ж, Раушская наб д. 4/5Заказ 1648/3 Подписное Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул,Проектная, 4 ЗначениявариантЧ,-у 71 (ВНИИСХМ) 21852 ф 782,56;2,82 СредняяОшибкау среднейду ЗначениявариантУь ошибкаразности ш П Различиядостоверны приР = 0,95 достоверны приР = 0,95