Среда для активации трансглутаминазы

(51)4 С 12 Н 9/10 13/ОО ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(56) Ьогапй Ь., СашрЬе 11 Ж 1 Ьев, Соорегвгедп Ь. А ЙПГег рарег аввау Еог ггапзааЫаг 1 п 8 епгушев цвп 8 гадоасгче апппе впЬвггагев, - Апа 1. В 1 осЬет., 1972, 50, Ч 2, р; 623-631.Го 11 З,Е. Аппп. Реч. ВхосЬеш, Тгапв 81 игаш 1 пазев, 1980, 49, 517-531.(54) СРЕДА ДЛЯ АКТИВЯИИ ТРАНСГЛУТАМИНАЗЫ(57) Изобретение относится к биохи-мии, в частности к энзимологии, иможет бьггь использовано в научныхисследованиях, связанных с определеМ 801446158 А 1 нием активности трансглутаминазы в биологических объектах, в клинической биохимии при диагностике нарушений свертывания крови, в пищевой про- мышленности для улучшения качества белковых заменителей натуральных мясных продуктов. С целью повышения степени активации Фермента трансглутаминазы в среду известного состава, содержащего хлорид кальция, дитиотреитол, буфер трис-НС 1, воду, дополнительно вводят бикарбонатный буфер (НСО + СО ) при следующем соотноше 3 1 нии компонентов, мас.К: хлорид кальция 0,020-0,100 дитиотреитол 0,050- 0,080, буфер трис-НС 1 0,60-1,200; щ бикарбонатный буфер Х(НСО + СО) 0,018-0,180; вода - остальное. Использование бикарбонатного буфера ( позволяет повысить удельную активность трансглутаминазы в 2,5-8,7 раз. = 2 табл.20 Изобретение относится к биотехнологии,Целью изобретения является повышение степени активации трансглутамина 5зы.Благодаря введению в состав средыбикарбонатного буфера скорость реакции образования внутри -и межмолекулярных изопептидных связей междуостатками глутамина белка и аминогруппами низкомолекулярных лигандовзначительно возрастает, что и определяет повьппение степени активацииферментав 2,5-8,7 раз.15П .р и м е р. В 1,0 И буферномрастворе трис-НС 1, рн 7,0 последовательно растворяют 1,0 г хлорида кальция и 0,8 г дитиотреитола и объемдоводят растворителем до 100 мл(состав 1). В бидистиллированнойводе растворяют 1,21 г бикарбонатанатрия, объем доводят до 100 мл ичерез раствор под контролем ионометра пропускают углекислый газ до рН 257,0 (состав 2), причем, суммарноеколичество углекислоты рассчитывают,Затем составы 1 и 2 объединяют вследующем соотношении, об. ч:Состав 1Состав 2, 2,2Вода 7,8Полученная среда для активациитрансглутаминазы содержит указанныекомпоненты состава в следующих кон35центрациях, мас.7:Хлорид кальция О, 100Дитиотреитол 0,080Буфер трис-НС 1 1., 200Бикарбонатный40буфер (НСОэ + СО) фрН 7,0 О, 180Составы среды представлены втабл. 1.Активация трансглутаминазы. В пробирку последовательно вносят субстраты реакции (путресцин и казеин),среду состава 5, а еатем фермент,выделенный иэ печени крыс, Реакциюосуществляют при 37 фС в течение5 мин. 0 степени активации судят по50увеличению скорости ферментативногопроцесса в сравнении с образцами, несодержащими в составе среды бикарбонатный буфер. Активность трансглутаминазы, инкубируемой в среде ,иэвест55ного состава, составляет 110 усл. ед.(1 усл. ед. акт. - 1 пкмоль путресцина, связавшегося с казенном, на 1 мгбелка Фермента за 1 мин), активностьтрансглутаминазы в полученной среде375 усл. ед,Эффективность активирующего действия среды доказана результатамиэкспериментов, представленными втабл. 2.Как видно из данных табл. 1 и 2,введение углекислоты в количествахменьше 0,0187 (состав 1 (НСО + СО)== 0,004%) не влияет или незначительно влияет на повышение активностифермента, Увеличение содержания углекислоты (вьпае О, 18%) не обеспечиваетдальнейшего повышения уровня актив"ности (состав 6: (НСО з + СО)= 0,264%) и не оправдывает дополнительного расхода реагентов.Увеличение ферментативной активности трансглутаминаэы в 2,5-8;7 разблагодаря использованию среды обеспечивает оптимальные условия приме.снения фермента для обработки белковых заменителей натуральных мясныхпродуктов, а также активацию фермен- .,та при необходимости в физиологических условиях (максимальная активность проявляется при рН 7,0-7,4),Использование предлагаемой средыдля осуществления трансглутаминаэной реакции в клинической и научноисследовательской практике позволитповысить эффективность проводимыхисследований за счет сокращениявремени их проведения, уменьшениярасхода реактивов,формула изобретенияСреда для активации трансглутаминазы, содержащая хлорид кальция, дитиотреитол, буфер трис-НС 1, бидистиллированную воду, о т л и ч а.ю щ а яс я тем, что, с целью повьппения степени активации, она дополнительно содержит бикарбонатный буфер (НСО + СО), рН 7,0-7,4 при следующем соотношении компонентов, мас.Е:Хлорид кальция 0,020-0, 100 Дитиотреитол 0,050-0,080 Буфер трис-НС 1 0,600-1,200 Бикарбонатный лбуфер (НСО 3+СО .)фрн 7,0-7,4 0,0 18-0, 180 Вода бидистиллированная Остальное1446158 Та блица 1 Содержание; мас, Х, в составе Ингредиентысреды О, 020 О, 060 О, 100 О, 100 0,050 0,070 0,080 0,080 0,060 0,100 0,200 1,200 0,009 0,018 0,044 0,180 0,264 Бикарбонатный буферНСОЗ СО 2 До 100 До 100 До 100 До 100 До 100 До 100 Вода Таблица 2 Показатели Состав среды1 1 1 1 рН 3 4 5 1 2 Активность фермента, усл. ед. 414,0 523,6 745,0 927,0 1160,0 1123,0 7,4 111,6 153,7 376,0 738,0 975,0 967,0 7,0 26 80 139 240 Повьппение активности в сравнениис прототипом, Е 0 124 180 11 7,4 571 780 774 7,0 Составитель А.Семенов Техред Л.Олийнык Корректор А. Обручар Редактор Г,Гунько Подписное Заказ 6706/30 Тираж 520.ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д 4/5