Штамм плесневого гриба f-154-продуцент гуанилрибонуклеазы

СОЮЗ СОВЕТСКИХссюаашаеснииРЕСПУБЛИК С 12 Н 15/00С 12 К 1/66 2 И 9/22,ИСАНИЕ ИЭОБРЕТ кукл с, 1 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРЙО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ М ОУНРЫТИЙ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(56) 1. Биосинтез микроорганизмамиеаз и протеаз. И., "Наука", 1979,.07-123.2. Безбородова С,И. и др. Способность низших грибов синтезироватьвнеклеточные РНКазы.-"Микробиология",1968) 37, 1.10.3. Авторское свидетельство СССРВ 651027, кл. С 12 К 15/00, 1976 прототип). 80.1126599 А(54)ШТАИИ НЛЕСНЕВОГО ГРИБА АВРЕКСЕЬЬЦЯ С 1.АЧАТ 08 Г- ПРОДУЦЕНТГУАНИЛРИБОНУКЛЕАЗЫ.(57) Штамм плесневого гриба. Аврегф 1 ив сачайив РКоллекцияЦентрального музея промышленныхмикроорганизмов института "ВНИИГенетика", коллекционный номер ЦМПИГ-продуцент гуанилрибонуклеазыИзобретение относится. к микробиологической и химической промышленности и представляет собой штамм,который может быть использован дляполучения фермента гуанилрибонуклеаэы,Рибонуклеазы получили широкоеприменение при расшифровке первичнойструктуры РНК, удалении РНК изразличных препаратов, получении Оолигонуклеотидов и нуклеотидов изРНК. Ведутся исследования по ферментному синтезу олигонуклеотидов сзаданной последовательностью звеньевпри помощи рибонуклеаз и по испольэо ванию РНКаэ для лечения ряда вирусных и опухолевых заболеваний. Рибонуклеазы являются также удобнымимоделями для изучения зависимостимежду структурой и функцией ферментов,В качестве основных продуцентов гуанилрибонуклеаэы используются грибы родов Аврегд 1.11 цв, Рцваг 1.цш, 25 Реп 1 с 111 цш, Мепговрога и др, Я .Гриб Аврегдх 11 Ьв с 1 ачагцв выделяет в питательную среду гуанилспецифичесКую рибонуклеаэу. Однако продуктивность культуры низкая: до 30 ед/мл при определении активности по модифиэированному методу Анфинсена и др. или 6270 ед/мл при определении активности по методу фирмы Уоггп 1 пцгош 121,Наиболее близким по технической сущности и достигаемои цели к пред35 лагаемому штамму является актиномицет Асг.1 пощусев ацгеочеггхсх Ьгцв, активно синтезирующий гуанилрибонуклеазу 31 с активностью 25-30 тыс, ед/мл, определенной по методу40 Татарской Р.И. и др., и длительностью хранения беэ пересева 1-2 мес.Недостатком этой культурыявляется значительная нестабильность, что заставляет для сохранения активности проводить непрерывную селекцию, Это недопустимо удорожает производство гуанилрибонуклеазы и не гарантирует стабильности свойств получаемого, продукта.50Целью изобретения является получение нового штамма, обладающего повышенной продуктивностью гуанилспецифической рибонуклеазы и стабильностью.":Поставленная цель достигается 55 тем, что в качестве продуцентагуанилрибонуклеазы используют штамм Ав рег з 1 0 1 ц в с 1 ачагцв Р54: Штамм Азрег 13 цз с 1 ачагцв Рдепонирован в Центральном музее промышленныхмикроорганизмов института "ВНИИгенетика" под номером ЦМПМ Р.Штамм образует гуанилспецифичес-кую рибонуклеаэу. Культуру выращиваютна питательной среде, содержащейсоевую муку, пелтон, глюкозу иминеральные соли.Штамм Азрегя 11 цз с 1 ачагцзпродуцент гуанилрибонуклеазы - получен в результате многократных моноспоровых рассевов культуры с последующим отбором вариантов с высокойпродуктивностью гуанилрибонуклеаэы.В отличие от известной культуры,предлагаемый штамм продуцируетгуанилрибонуклеазу в количестве до60 ед/мл по модифицированному методуАнфинсена и др. или 12540 ед/млпо методу фирмы Уог 1 МщГоп и имеетвысокую стабильность - сохраняетспособность продуцировать гуанилрибонуклеазу при хранения не менее 15лет без селекционной работы,Гуанилрибонуклеаэа Азрегях 3 цв сачаГцв эффективна в синтезе тринуклеозиддифосфатов Биоорганическая химия",/ц1976, 2, 1111:, 1977, 3, 1475) .Предлагаемый штамм имеет следующие характеристикиМорфологические признаки.Высота конидиеносцев до 1 мм,толщина около 35 мкм, размер вэдутий140-19065 мкм, размер головок 400700 мкм, боковых стеригм 7-9 2,5 мкм,верхних 9-112,5 мкм, конидий -4-6 на 3,5-4 мкм.Культуральные признаки,Штамм растет при 24 С и рН средыО,5,7 - 5,9.При выращивании на твердой среДеЧапека на третьи сутки роста колонииплоские, голубовато-зеленые, 1,9 смв диаметре с узким белым краем икрупными каплями экссудата, К пятымсуткам колония достигает 4 см в диаметре, серединка приподнимается,образуется один спороносный валик,колония становится порошистой, каплиэкссудата мельче. К 1 0-м суткамколония 5 см в диаметре, порошистая,темно-сизо-голубоватая с мелкимикаплями экссудата. При выращивании на картофельноморковной среде и РСА на третьисутки колонии голубовато- зеленые,1,8 см в диаметре с приподнятой126599 3серединой. Воздушный мицелийразвит слабо, крупные капли экссудата. На пятые сутки колонии 3 см вдиаметре, серо-голубые с приподнятойсерединой и двумя валиками споронос ных эон, на которых расположеныкапли экссудата; Край колонии паутинистый, голубовато-зеленый. Обратнаясторона бесцветная., К 9 - 10-м суткамколония достигает 4,5 см в диаметре, рпаутинистая, зеленовато-серого цвета,с горками спор по зональному валику.На картофельно-глюкозовой среде иРДА на третьи сутки колония 2,5 смв диаметре, голубовато-зеленая, 15компактная с широким белым краем,приподнятой середгчой. Большие капли .экссудата. К пятым суткам диаметрколонии 4,5 см, цвет. серо-голубой,имеется спороносная середина и дваспороносных валика. Край колониипаутинистый, белый. Экссудата нет.Обратная сторона желтоватая,К 9-19-м суткам диаметр колонии5 ем, колония резко зональная порошистая, голубовато-серая. Обратнаясторона желтоватая, Мелкие каплиэкссудата.На солодовой среде на третьисутки роста диаметр. колонии 1,2 см,цвет голубовато-зеленый, середина30приподнята. Скудный воздушныймицелий. Имеется экссудат. На пятыесутки роста диаметр 4 см, колонияприжатая, паутинистая с однимспороносным валиком серо-голубого Ицвета. Край колонии паутинистыйсеро-зеленый. Редкие капли экссудата,Обратная сторона бесцветная,К 9-1 О-м суткам роста диаметрколонии достигает 6 см, колония поро шистая, голубовато-серая, в центререзко зональная с валиком спор.Капли экссудата,При глубинном выращивании насреде, содержащей,%; глюкоза 5,0; ф 5пептона 1,0; МАЗО 7 Н О 0,5;СаСР 2 Н О 0,01; КМО 0,2 приЭ у24 + ОС мицелий пре ставляет собойбледно-зеленовато-желтую равномернуюгрибницу, состоящуюиз длинных развет- вленных гиф, постепенно переходящихиз одной фазы развития в другую.Физиологические признаки.Хорошо усваивает сахарозу, глюкозу, хуже маннозу, фруктозу, маннит, йглицерин.Пептонизирует молоко. Разжижаетжелатину. Гидролиэует крахмал. Обра. 4зует внеклеточную гуанил-специфичную РНКазу, гомологичную РНКаэе.Аярегцг 1 ия огуяае при выращиваонии в колбе при 24+1. С.Наибольшая активность гуанилрибонуклеаэы в культуральной жидкостиимеет место у 3- и 5- суточныхкультур. Максимальная активность,внутриклеточного фермента наблюдаетсяу 3- суточных культур,Суммарная активность культуральной жидкости в 3-10 раз превышаетсуммарную активность мицелия,При действии культуральной жидкости на рибонуклеиновую кислоту вкачестве продуктов гидролиза обнаружены и идентифицированы адениловая,гуаниловая, уридиновая и цитидиноваякислоты,Приготовление питательных сред.Картофельно-морковная среда, г/л:картофель 20,0; морковь 40,0; агар+2,0.Картофельно-глюкозная среда, г/л:картофель 200,0; глюкоза 20,0;агар 2,0.Солодовая среда, г/л: солодовыйэкстракт 20,0; агар 2,0.П р и м е р 1. Культуру Аярегя 1 01 ця саыагця Г-.154, хранящуюся наскошенном агаре на среде Чапека ссахарозой, выращивают на среде,содержащей , г/л; соевая мука 0,5;глюкоза 5,0; пептон 1,0; Мя 804 7 Н О0,05; СаС Р беэв. 0,01; КИОТ 0,2(рН до стерилизации 6,2 - 6,3), втечение суток при 24+1 С в колбахемкостью 750 мл "с объемом указаннойсреды 00 мл на качалкепри 180200 об/мин, Посевной материал в количестве 10% добавляют в среду вышеуказанного состава и культивируют при тех же условиях ь течение 3 сут. Активность гаунилрибонуклеазыопределяют при рН 7,8 с использовакием в качестве субстрата дрожжевойРНКа(НПО "Биохимреактив")и выра-. жают в спектрофотометрических единицах(Е Дв пересчете на 1 мл исследуемой жидкости(Безбородова С.И. и др."Микробиология", 1968, 37, 1, 10).Активность гуанилрибонуклеазы 48,0 ед/мл(9338 ед/мл по методу фирмы ЫоггЬ 1 щгоп).П р и м е р 2; Подготовку посевного материала проводят так, как описано в примере 1.Полученную культуру в количестве 10% используют для засева ферментаЗаказ 8640/20 Тираж 521 . ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий1 13035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5 филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул.Проектная, 4 тора - инокулятора(емкость фермента- тора 30 л, объем среды 20 л.Выращивание инокулюма проводят нри 241 С, при перемешивании 300 об/мин и аэрации 0,6 объема воздуха на 1 объем среды в минуту на среде, указанной в примере 1. :Через сутки выросшкйинокулюм в количестве 10 Ж от объема среды передают в ферментатор емкостью 100 л, содержа: щий 70 л указанной среды. Культивируют 72 ч при 24+1 С, перемешнваниио300 об/мин. К 72 ч ферментации активность культуральной жидкости составляет по гуаиилрибонуклеазе 60,0 ед/мл,(12546 ед/мл по методу фирмы ЮокйЬ 1 пфоп) . Затем культураль; ную жидкость обрабатывают известными приемами с последующим выделениемгуанилспецифической рибонуклеазы .Безбородова С.И, и др., "Биохимия",1969, 34, 6, 1129-1130). Испытания штамма Аерег 8 Ьззс 1 амайцз Рв ферментаторах НПО "Биохимреактив" г. Олайне покаэалй его высокую продуктивность по.гуаф ннлспецифической рибонуклеазе:к 72 ч культивирования штамм продуцирует гуанилрнбонуклеазу с активностью 40 - 60 ед/мл по модифицированному методу Анфинсена и др.(8366- 5 2540 ед/мл по методу фирмы ЯогСЬдпйоф весьма высокую стабнльностЬ (штамм хранился на скошенном агаре без снижения активности 15 лет) .