Биологический способ определения экдистерона в теле насекомого

СС 103 ССВЕТСНИХййИЧИОПН 6 ЮаРЕСПУЬЛИЙ 69 Ш) Ва) С 12 Я. 01/32 Е ИЗОБРЕ и ГОСУДАРСТЖНННЙ КОМИИЛ СССР 00 ДЮАМ ИЭСВРОЕНИЙ И ОМИРМТ(54) (57) БИОЛОГИЧЕСКИЙ СПОСОБ . ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭКДИСТЕРОНА В ТЕЛЕ НАСЕКОМОГО, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности анализа и сокращения времени его проведения в брюшко насекомого производят трансплантацию слюнной железы личинки РговорЬ 1.1 а чдгИв, железу инкубируют в насекомом 15- 60 мин, затем извлекают ее из брюшка готовят давленый ацето-орсеиновый препарат и проводят кариологический анализ препарата, при этом о наличи зкдистерона судят по экспрессии пуфов в индикаторных районах.1126600 3Изобретение относится к сельскохозяйственной, медицинской и лесной йднако способ наложения лигат УРогранйчен личиночной ста ней "Кэнтомологии и биологии а именно ф " р на ок методам биологической борьбы сЭ орв тест треб ет на ор у накопления синхровреднымй насекомыми, и может бытьнизированного материала ля ид получе-.5 ния гомогенатв(10-15 г) а коиспользовано в сельскоми лесном( ), а количестхозяйстве, в также в медицине ввенная оценка гормона по нему затруд,нена, так как гормон те яетсякачестве экспресс-тест-системыляр я вопределения биологически активных идля процессе многократной об аботр ки иатевеществ. 0риала и в нем могут быть прииес и,токсичные для реципиента что сВ настоящее время с целью охран ы надежность способа иоо снижаетбиосферы исследуются возможности, рад оиммунныйиспользования биологических методовспособ трудоемок, технически сс , ложен,борьбы с насекомцми-вредителями, бпродолжителен анализ по нему длитсяолее 3 мес , включает в себяОдним иэ таких подходов может быть 15я работуиспользование гормонов насекомьа ес высокотоксичными и р иоактвд ивнымивеществами. Использование его вдля регуляции численности популяцийэнтомологнческой лабо атоьннеобходим способ определения наличия Ци биологической активности гормоновель изобретения состоит в повыов 2 О шенин точности анализа и сокна разных стадиях развития особей времени его проведения,ращении. Для определений экдистерона " ,Указанная ельодного из ан г, казанная цель достигается. тем,влогов гормона линьки на что согласно биолог чсекоиых экдизона - извес еиологическому способуест и способ определения э исте оналожения лигатур, который звключа- окд терона в теле нвсе.ся в том, что личинок насекомыхет.звключа коиого производят трансплантациюозор айа,слюнной железы личинки Рг Ьтрети тела и по окуклич 1 гйэ в брюшко насеконикубируют в насекомом 5 Ысудят о наличии гормона в них Я .извлекают ее иэ б юее иэ рюшка, готовятИзвестен та,же способ Каллфортест , технически более сложный.илл ора- и проводят ка иологр л гический анализчеи способ наложения лигатур. ОнжФрепарата, п и этомр м о наличии экдистерона судят по экспрессии пу в воснован на экстракции экдистерона индикаторных районах.иэ гомогенвта анализируемого насекомого метанолом, бутвнолом и пет- З 5 Првлейным эфиром, Конечный продуктр и и е р 1. На жуке ТепеЬгошо 1 огбольшой мучной хр ак 1.экстракции после многократного ные железы личинок РгоэорЫ 1 а чьг 1 Иреэкстрагирования инъецируюта уьг 1 дв,личинкам Квлли в в блиния Р - 40 на 46-50 фора в рюшной отдел ночного возраста выделяют в О,бй-номза лигатурой и по размерам склероти" 4 Орастворе МвСв и трансплантируют взнроввнной кутикулы в отшнурован-, б рюшко куколок реципиента на рвзнйхнои сегменте определяют титр экдизона 2.насроках развития, культивируют их30 иин, затем готовят давленыеацето-орсеиновые препараты хромосомРадиоимиунный способ определения следующим, образом: переносят железуа предметное стекло,экдистерона наиболее сложен. Он из краски на предмет евключает в себя накопление синхрони . краску удаляют, помещают железу взированного материала анализируемой каплю насыщенного раствора хлорапстадии 5 мг сухого веса), которыйподвергают сложной обработке для 5 О через 3-4 с), смывают его 453-нойпо 51 гоантнгенного связывания с меченым уксусной кислотойто , помещают железупо 1 гормональным производным,в каплю 503-ной молочной кислоты;синтез и очистку экдизонового произ" покрывают покровным стеклом, прижимаяводного, получение экдистерон-альбу- его к предметно иу, и проводят кариоминового комплекса, которым иммуни" . 55 логический анализ индикаторных райо-.зируют кроликов и определяют анти- нов хромосом показ ва й,оказывающи , что нвсывороточную специфичность по техни- стадии 4-дневнойке диализа 31.31.о куколки в хромосомахслюнных желез присутствуют все пуфыЗаказ 8640/20 , Тираж 521 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий13035, Москва, 3-35, Раушская наб., д.4/5 филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4:индикаторы, что указывает на высокое содержание экдистерона в гемолимфе куколок жука и проницаемость гормона в клетки трансплантата, Полученные данные хорошо согласуются с литературными по содержанию экдистерона в процессе развития ТепеЬгдо шоВгог, выявленному по радиоиммунному способу 4 .Н р и м е р 2. На клопе,ЕогЦазгег 10 дпгеЕгдсерз вредная черепашка). Условия культивирования желез личинок дрозофнлы в брюшке этого насекомого способ приготовления давленых ацетоорсеиновых препаратов хромосом н 13 кариологнческийанализ их такие же, как в примере 1. ариологический анализ индикаторных районов хромосом трансплантата на стадии личинки этого клопа выявил присутствие 20 четких пуфов в конце личиночного возраста(5-дневные личинки ЕцгдЕавйег 7 возраста), что говорит о присутствии и высоком содержании экдистерона в гемолнмфе этих особей, как,н у д ТепеЬгдо(4-дневная куколка, пример1). На стадии имаго самки ЕцгдЕавгег в диапаузе пуфов-индикаторов не име", ли, как и личинки более ранних," строков развития, в трансплантатах которых наблюдали лишь отдельные слабо развитые пфы, что интерпрети: руется как резкое снижение содержания гормона в их гемолимфе. Трансплантаты из брюшка яйцекладущнх самок ЕигдЕазйег имели все пуфы 35 индикаторы, кроме пуфа 2-. 3 -3, что свидетельствует о наличии в гемо" лимфе незначительного количествагормона, так как пуфы выражены слабо. Таким образом, данные примеров 1 н 2 достоверно подтверждают воэможность определения экдистерона в гемолимфе насекомых-вредителей посредством пуффинга полнтенных хромосом трансплантата на разных стадиях развития испытываемого насекомого.В качестве трансплантата кроме слюнных желез ЭпозорЬдда удгд ддз могут быть использованы органы всех насекомык; обладающих тканями с полнтенным кариотипом.Разработанный способ определения зкдистврона в теле насекомого посредством пудинга индикаторных районов хромосом трансплантата может быть использован на всех стадиях развития реципиента, не требует накопления синхронизированного материала исследуемого насекомого, дает возможность определять экдистерон непосредственно в теле насекомого, устраняет потерю гормона в процессе обработки, что существенно повышает надежность способа, сокращает продолжительность анализа до 3 дн,148 ч- срок развития дичинки дроэофилы,7 ч - кариологичес-кий анализ), исключает многочисленные трудоемкие операции и применение высокотоксичных и радиоактивных веществ. Техническая просто. та предлагаемого способа позволяет использовать его как экспресс"тест на экдистерон непосредственно вФполевых условиям.