Способ получения 5-или 3-фосфоамидов моно-или олигонуклеотидов

Р 39М.Б.Готт ена Ленина,Революции и ордего Знамени госуитет иМ.М.В.Ломо 8)И., Носова В,В.офьев М.А. Новыв олигонуклеоти1972, 206, Р 1 нская Л.Г.Рухляокофьев М.А тидов.В 3, 613 Гат в В.ДОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРпО делАм иЗОБРетений и ОтнРЪГГий ОПИСАНИЕ АВТОРСКОМУ С 1) 338806 3/23-042) 28. 01, 82(71) Московский ордордена Октябрьскойна Трудового Краснодарственный универсносова(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 5 - ИЛИ3-ФОСФОАМИДОВ МОНО- ИЛИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ путем конденсации нуклеотиднойкомпоненты с аминной в растворителе вприсутствии производного карбодиимида, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью упрощения процесса иувеличения выхода целевого продукта,в качестве нуклеотидной компонентыиспользуют водорастворимые соли нуклеотидов, в качестве растворителя "воду, в качеСтве производного карбодиимида - 1-этил-(3-диметиламинопропил )карбодиимид, в качестве аминной компоненты - водный раствор амина с рН 4,5-10, при условии, что рН араствора амина на 1+0,1 меньше рК ЕИзобретение относится к способуполучения фосфоамидов моно- или олигонуклеотидов, которые широко используются н биоорганической химии и молекулярной биологии в качестне исходных соединений для получения соответстнующих ди- и трифосфатов, реагентов для аффинной модификации белкови нуклеиновых кислот, а также дляхимической "сборки" полинуклеотидовн матрично-направленных реакциях. 1 ОКроме того, соединения этого класса,содержащие н своем составе остатокаминокислоты или пептида, используются в молекулярно-биологических исследованиях в качестве моделей природных нуклеопротеидов.Известен способ получения 5 - или3 -Фосфоаглидов глоно- или олигонуклеотидо в пут егл взаимодействия смешанныхан гидридо в с ме з и тиле н к ар боновой ки слотой г.1).Сначала получают смешанный ангидрид нуклеотида и мезитиленкарбоновойкислоты при действии хлорангидрида1 кислоты в безводном пиридине, затемизбыток реагента удаляют экстракциейэфиром и к остатку добавляют аминлибо н водном, либо н безводном растворе. Если ам 1 лн добавляют безводнымпроцесс заканчивается через несколько часов, а в водной среде - .через2-3 сут. Для пронедения первой стадии - получения смешанного ангидриданеобходимо предварительно переводитьмоно-. или олигонуклеотид в соответствующую растворимую в пиридине фор- З 5му, например,три-н- алкилаглглониевую.Этот способ практически нельзя применять для получения амидов олигонуклеотидов риборяда, так как н результате ацилирования межнуклеотидных Фос ОФатных групп в значительной мере происходит разрыв и изоглеризацИя межнуклеотидных связей. Крогле того,при работе со слабыми аминами рК5 эфФективность способа заметно понижает ся,Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаеглому положительному эффекту является способ получения 5 -или 3 -Фосфоамидов5 О моно- или олигонуклеотидов, заключающийся в конденсации нуклеотидной коглпоненты (пиридиниеной или три-н-алкиламмонийной соли глоно- или олигонуклеотида ) с безнодным амином н безводном органическом растворителе (безводный пиридин или диметилформаглид ) в присутствии производного карбодиимида (дициклогексилкарбодиимида ), Процесс протекает в течение 2-3 сут при 37 . Выход целевого про- бО дукта 50-80 Г 2 3,Недостатком известного способа получения является относительно низкий выход целевого продукта, При длительном ныдерживании олигонуклеотидов в безводных растворителях в присутствии дициклогексилкарбодиимида происходит нежелательная модификация межнуклеотидных фосфатных групп, причемстепень модификации возрастает с увеличением длины олигонуклеотида.Недостатком способа является такженеобходимость проведения процесса вбезводном растворителе, так как длякрупных олигонуклеотидных блоковпрактически невозможно количественноперевести олигонуклеотид н растворимое в органическом растворителе состояние.Кроме того, указанный способне дает возможности получать амиды,содержащие в своем составе остаткисильных аминов, значение рК,г, которыхболее 10, что связано, с одйой стороны, с плохой растворимостью олигонуклеотидов при добанлении таких аминови с другой стороны, с низкой реакционной способностью дициклогексилкарбодиимида в присутствии сильных аминов.Целью изобретения является упрощение процесса и увеличение выходацелевого продукта,Цель достигается согласно способуполучения 5 - или 3-Фосфоамидов моно- или олигонуклеотидов, заключаю)щемуся в конденсации в водной средеводорастворимых солей нуклеотидов сводным раствором амина с рН 4,5-10при условии, что рН раствора аминана 110,1 меньше рК амина, н присутствии конденсирующего агента - 1-этил-(3-диметилаглинопропил )карбодиимида,Выход целевого продукта 85-100,При рН, меньших 4,5, начинается конкурентная реакция гидролиза образующегося фосфоамида, в результате чего выход Фосфоамида понижается,Существенными отличиями предлагаемого способа получения является использование в качестве нуклеотиднойкомпоненты водораствориглых солей нуклеотидон, в качестве растворителяноги, в качестве производного карбодиимида-этил-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид, в качестве аминнойкомпоненты - водного раствора аминас рН 4,5-10, при условии, что рПраствора амина на 1+0,1 меньше рКамина.П р и м е р 1, К 1 мкмоль Яа-солиЯрТ (10 ОЕ 26 , упаренный до маславодный раствор ) добанляют 100 мнл3 М водного раствора имидазсла ( рК=7,0 ), предварительно титронанного спомощью 6 н. водной соляной кислотыдо рН 6,0, Затем добавляют 10 мг50 мкмоль ) 1-этил-(3-диметиламинопропил )карбодиимида и через 2 ч при20 С полученную смесь фракционируютос помощью электрофореза на бумаге в0,05 М триэтиламглонийном буфере с рН1049498 Моно- илиолигонуклеотид Кон Амин рем самиФ ронуклео тида,М ссч 0,0 Имидазол Морфолин а Т МетилоэФирглицин 90 Ир нили(тц села 6 стр) 0,00 б,8,7,25 оли Метиловыйэфирглицина 5 75 ил 0 0,003 идазоилии 4,6 и м е ч а н и е. Во всех случаях, указанныхкарбодиимида 0,5 М, конценционная среда - вода. нцентрация 3 М, реактаблице,ация амин амида добморфолина ло 7,5-8,0. Выход имидазольного производного дезокситимидиловой кислоты практически количественный. Полученное соединение идентифицируют с об-разцом, полученным ранее другим способом.П р и и е р 2. Водный раствор сг( ьСССИАЬЕрч Н+ - соли, содержащий 1 ОЕ, 10 нглогь вещества, упаривают до масла, добавляют 100 мкл 3 М водного раствора морфолина (рК =)О =8,3), предварительно титрованного с помощью б н. водной НС 1 до рН 7,25. Затем добавляют 10 мг (50 мкмоль) 1-этил-(3-диметиламинопропил)карбодиимида и после выдерживания полученной смеси в течение 5 ч при 20 С олигонуклеотидную фракцию выделяют из смеси путем гель-фильтрации на биогеле Р. Анализ олигонуклеотидов, выполненный методом микроколоночной хроматографии на анионообменной смоле, свидетельствует о том, что морПриведенный пример. К раствору4 мг (0,01 ммоль ) пиридиниевой солиарТ в 0,2 мл безводного диметилформфолид дека ну клеотида полу чают с . выходом 90.П р и м е р З.,Водный раствор(РА.Г) в виДе )а-соли (2 ОЕ 2,Г20 йглоль ) упаривают до масла и до-,бавляют 100 мкл имидазола (рК =7,0)титрованного до рН 6,0 с помощьюб н, водного раствора соляной кислоты, Затем добавляют 10 мг (50 мкмоль)1-этил-(3-диметиламинопропил ) в карбодиимида и после выдерживания полу)ченной смеси в течение 3 ч при 20 Солигонуклеотиды обессоливают методомгель-фильтрации на биогеле Р. Анализ олигонуклеотидной фракции, выполненный методом микроколоночной хроматографии на анионообменнике, свидетельствует о том, что имидазолид гептаадениловой кислоты получают с выходом 85,Данные для других примеров получения амидов моно- и олигонуклеотидов представлены в таблице. вляют 17 мкл (0,2 ммоль ) и 20 мг (0,1 гоголь ) дицикрбодиимида, РеакционнуюЗаказ 8359/26 Тираж 387 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Жр Раушская наб., д.4/5Филиал ППП "Патент", г,ужгород, ул.Проектная, 4 смесь выдерживают 3 сут при комнатной температуре и добавляют 0,5 млводы. Через 10 ч избыток карбодиими-,дз экстрагируют эфиром, мочевину отфильтровывают и из водного слоя методом бумажной хроматографии или электрофореэа выделяют морфолид дезокситимидиловой кислоты с выходом 50.