Олигонуклеотид в качестве расщепляемого зонда и способ его получения

атИЩу.у"ИБЛИ - . ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТЕНТУ ЬЭ О О О О О Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам(71) Химический факультет МГУ им, М.В.Ломоносова.16, В 2, с. 219-225.2. Магап 95.А. Тетгапебгоп, 1983, Ч, 39,М 1, р. 3-22,Изобретение относится к области биоорганической химии, а именно к получениюолигонуклеотидов общей формулы0й,0-1-ин-сн - ср,2 я 2ОНгде В 1"5 АССТАССЗВ 2=5 ТООТОО СЗ .которые могут использоваться в качестверасщепляемых зондов в гибридизационноманализе нуклеиновых кислот, реагентов длянаправленного мутагенеза в генной инженерии, в качестве аналогов субстратов приизучении механизма действия ферментовнуклеинового обмена в энзимологии, а также в различных молекулярно-биологическихисследованиях по белково-нуклеиновымвзаимодействиям,Единственным аналогом сходной структуры, обладающим сходным свойством направленно расщепляться по Я 2 2000300 С(54) ОЛИГОНУКЛЕОТИД В КАЧЕСТВЕ РАСЩЕПЛЯЕМОГО ЗОНДА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ(57) Использование; в качестве расщепляемого зонда. Сущность изобретения: продукт - олигонуклеотид ф-лы В 100)Р(ОН)-МН-СН 2-С(О)ОВ 2, где В 1=5 АССТАССЗ В 2 5 ТООТООСЗ, Выход 480. Реагент 1. смесь этилового эфира глицина и 1-этил-З.З-диметиламинопропилкар 1бодиимида. Реагент 2: гептануклеотид б(ТООТООТ) и тетрадекануклеотид б(ТООАТООАССАССА). Условия реакции при рН 6,0 в присутствии 0,01-03 М 1-этил,3 -диметиламинопропилкарбодиимида. 2 с,п.ф-лы, 2 ил. межнуклеотидной связи в заданном положении, является олигонуклеотид:0 О10 0 - Д 1 /0 С,Н, 0 Нгде В 1=5 АССТАССЗВ 2=5 ТООТОО СЗ .Указанное соединение (1) может расщепляться по замещенной пирофосфатной связи при обработке его различными нуклеофильными агентами. Недостатком этого типа соединений является их высокая реакционная способность, что приводит к тому, что зонд при работе с ним может неконтролируемо расщепляться. Причиной этого является легкость расщепления замещенной пирофосфатной связи при действии нуклеофильных компонентов буферных смесей.Способ получения соединениязаключается в конденсации двух олигонуклеоти 2000300дов (И) и (И 1) на комплементарной матрице(1 Ч) под действием водорастворимого карбодиимида. вводится неприродная сложнозфирна, которая по гидролитической устойчивости превосходит замещенную пирофосфатную в аналоге (1), Больная гидролитическая ус 5 тойчивость его обеспечивает стабильностьсоединения при работе с ним, исключает воэможность неконтролируемого расщепления зонда и уровень неспецифических по 1 Ч 1 оодораспборциыц бочных реакций. В то же времякербеоооноо 10 спожноэфирнеп сексе можетпегко и колике.5 АССТАСС-Р-9 - ТССТССТ 3г и1ственно расщепляться в условиях мягкой0 СН 5 ЬН щелочной обработки, что позволяет расще ТССАТСС5 АССАССА 5 пить предлагаемый зонд направленно поэтой модифицированной связи.15 Способ получения соединения (Ч) засоединения (И) в качест- ключается в конденсации двух олигонуклеоДля получения соедиве исходного используетсяз ется полученный по тидов (Ч 1) и (Ч 11) под действием стандартной методикеике на автомате-синте- водорастворимого карбодиимида в присутэаторе олигонуклеотидотид АССТАССр. Этот ствии третьего олигонуклеотида (1 Ч), выпололигонуклеотид превраевращается в соответст няющего роль комплементарной матрицы, вующий 3-этиловый эфир(И) путем конден- Схема реакции;сации с этанолом в присутствииводорастворимого карбодиимида. Другойолигонуклеотид ТООТООТ, также полученный на автомате-синтезаторе, фосфорилируется по 5-концу с помощьюаденоэинтрифосфата(АТФ) и фермента пол 1 ч Водорасвборцмый инуклеотидкинаэы. Образующийся фосфоЧ карбодиц.мцд рилированный олигонуклеотид (1 И) послевыфления и очистки конденсируется с оли,гонуклеотидом (И) в присутствии комплвментарной матрицы (1 Ч) и конденсирующегоагента - водорастворимого кэрбодиимида.Недостатком описанного способа получения является многос-адийность, а также35наличие дорогостоящей стадии ферментативного фосфорилирования с помощью поли нуклеотидкиназы, требующейспециальных обработок по удалению фермента и АТФ, а также стадии выделения 40фосфорилированного олигонуклеотида (И 1).Цель изобретения - получение новогоолигонуклеотида общей формулы 11 О О Ие --к,О НО,Н5 ДССТАСС Р Р-Т СС Т ССТ 35 ТССАТСС 5 АССАССА 5ОСН НО Ч СН -СООН ЧИ АССТАССр-йН НО - ТССТССе ееТССАТСС АССАССАмн-сн -с-о12 ва.пность указанных обличитель.аков позволяет сугцеотрр нно упн где В -5 АССТАССЗ5082=5 ТООТООСЗ,в качестве расщепляемого зонда и способ его получения. отличающегося от аналога большей легкостью получения и более высокой гидролитической устойчивостью, что 55 делает этот зонд более доступным и удобным для практического использования.Поставленная цель достигается тем, что в заданное положение олигонуклеотида вместо природной межнуклеотидной связи Для получения олигонуклеотида (Ч 1) проводится конденсация исходного олигонуклеотида АССТАССр с этиловым эфиром1глицина в присутствии 1-этил-З,З-диметиламинопропилкарбодиимида. После щелочного омыления сложноэфирной связи образующийся олигонуклеотид (Н 1) конденсируется с олигонуклеотидом (ЧИ) в присутствии комплементарной матрицы (Ч) и конденсирующего агента - водорэстворимого карбодиимида.Отличием предлагаемого способа от способа получения аналога (1) состоит в том, что в качестве исходного соединения вместо 5-фосфорилированного олигонуклеотида (1 И) используется его нефосфорилированный предшественник (НИ). Исключение этой стадии фосфорилирования очень важно, так как, во-первых. эта стадия требует наличия1дорогостоящего фермента - 5 -полинуклеотидкиназы и, во-вторых, исключаетсятрудоемкий этап выделения 5-фосфорлиро. ванного олигонуклеотида на хроматографических носителях импортного производстСовокуых признростить процесс, сократить длительность приготовления зонда, снизить стоимость за счет использования недорогостоящих компонентов.П р и м е р 1. К водорастворимой соли олигонуклеотида д(АССТАССр) (0,7 ое 260, 0,01 мкмоль), полученного по стандартной методике на автомате-синтезаторе, прибавляли 50 мкл 1 М водного раствора этилового эфира глицина и 5 мг 1-этил,3 -диметиламинопропилкарбодиимида, Смесь выдерживали 3 ч и олигонуклеотид выделяли методом гель-фильтрации на биогеле Р 2, используя воду в качестве элюента,Полученный после гель-фильтрации водный раствор упаривали и добавляли 0,1 н.водный раствор 1 чаОН. После выдерживания смеси в течение 20 ч и нейтрализации ее 40-ной уксусной кислотой делали повторную гель-фильтрацию нэ той же колонке. Водный раствор олигонуклеотида упари вали, добавляли эк в имоля рное (0,7 ое, 0,01 мкмоль) количество водорэстворимой соли олигонуклеотида (Ч 11) и зквимолярное (1,4 о,е., 0,01 мкмоль) количество олигонуклеотида (1 Ч). Смесь олигонуклеотидов растворяли в 280 мкл 005 М морфолиноэтансульфонатного буфера с рН 6,0, содержащего 0,02 МдС 12 и 10 мг 1-зтил-(3 -диметиламинопропил)карбодиимида,Смесь инкубировали 48 ч при 0 С и затем целевой олигонуклеотид (Ч) выделяли методом электрофореза в 20-ном полиакриламидном геле, содержащем 7 М мочевину при постоянном напряжении 1000 В. Выход олигонуклеотида (Ч) составил 60 относительно исходного олигонуклеотида (Ч 1),П р и м е р 2. К водорастворимой соли олигонуклеотида б(АССТАССр) (0,025 о.е.260, 0,5 мкмоль), полученного фосфотриэфирным методом по стандартной методике 2 добавляли 30 мкл 1 М водного раствора этилового эфира глицина и 5 мг 1-этил-(3- диметиламинопропил) карбодиимида. Смесь выдерживали 3 ч при 10 С и олигонуклеотид выделяли методом гель-фильтрации на биогеле Р 2, После омыления по вышеописанной методике олигонуклеотид Ч 1 смешивали с эквимолярным количеством олигонуклеотида (Ч 11) (0,025 о,е, 260, 0,05 нмоль) и олигонуклеотида (1 Ч) (0,05 о,е., 0,5 нмоль) в 10 мкл 0,05 М морфолиноэтансульфонатного буфера с рН 6,0, сорержаще 0,02 М МдС 12 и 0,2 М 1-этил-ЗЧЗ-диметилэминопропил)кэрбодиимида. Смесь инкубировали 48 ч и целевой олигонуклеотид выделяли методом электрофореза в полиакриламидном геле, как описано в примере 1. Выход олигонуклеотида (Ч) относительно исходного (Ч 1) составил 48. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Г 1 р и м е р 3, При выполне ни,ч нтеза в тех же угловиях, что и в примерг 2. но при времени инкубации 24 ч, выход плипнуклеотидэ (Ч) составил 287 ь.Способ испытания предлагаемого зонда. Основная характеристика расщепляемого зонда - его гидролитическая устойчивость, При нейтральных значениях рН в водном растворе олигонуклеотид (Ч) устойчив и может храниться при -20"С в течение нескольких месяцев.При инкубации зонда в буферных растворах. традиционно использующихся в биохимических исследованиях и содержащих такие нуклеофильные компоненты как трис-, меркаптоэтанол, спермидин, 1 ч-метилимидэзол, расщепление зонда не обнаружено, в отличие от аналога (1).На фиг.1 приведен радиавтограф 207 ьного полиакриламидного геля иллюстрирующего стабильность Р-меченного зонда32(Ч) при инкубации его в различных буферных растворах,Дорожка 1 - исходный олигонуклеотид (Ч), 2 - олигонуклеотид (Ч) после инкубации в 0,05 М трис-буфере (рН 9.0), содержащем 0,01 М йдС 12, 0,002 М спермин, 0,005 М меркаптоэтанол (37 С. Э суток), 3 - олигонуклеотид (Ч) после инкубэции в 0,4 М М-метилимидазольном буфере (рН 8,0). содержащем 0,2 М йаС 1 М 0,12 М МдС 12 (37 С, 3 суток).Для сравнения на том же геле нанесен олигонуклеотид-аналог (1) (дорожка 4) и продукты его расщепления в тех же условиях, что в подписи к дорожке 3 (дорожка 5).На фиг,1 видно, что в условиях, когда аналог (1) целиком расщепляется, предлагаемый нами зонд (Ч) устойчив. Устойчивость зонда в условиях, приведенных выше, свиде ельствует о том, что он может использоваться в различных исследованиях без побочных неконтролируемого расщепления в условиях, близких к физиологическим.Направленное расщепление олигонуклеоидэ Ч Основное отличительное свойство олигонуклеотида (Ч) заключается в том, что при создании определенных условий он может расщепляться направленно по модифицированной межнуклеотидной связи.Так, при обработке зонда (Ч) водным раствором пиридина с триэтиламином или водным раствором конц. ИНОН в течение 16 ч происходит эффективное расщепление зонда.На фиг.2 приведен радиоавтограф 207 ьного полиакриламидного геля, где дорожка 1 - "2 Р-меченный исходный зонд (Ч), 2 - з-Р-меченный олигонуклеотид (Ч 1): 3 - продукт расщепления зонда Я смесью пири,. г 1 1/ , Г , 9 / дин триэтиламин - вода (3:2:5) в течение 16 ч при 20 С, 4 - продукты расщепления зонда концентрированным раствором водного аммиака(16 ч. 20 С),На том же геле на дорожке (6) нанесены продукты реакции зонда (Ч) с 0.5 М водным раствором этилендиамина (рН 8,0) (37 С, 6 ч), Дорожка (5) - контрольный олигонуклеотид структурыОб(АССТАССр СН 2-СОЙН-(СНЙ - МН 2)(ЧИ 1). Подвижность продуктов реакции в геле свидетельствует о том, что зонд(Ч) расщепляется под действием этилвндиамина в мягких условиях в водной среде, и при этом остаток этилендиамина присоединяется по карбоксильной группе олигонуклеотида. Такой ход реакции подтверждается путем идентификации продукта расщепления зонда (Ч) этилендизмином со специально синтезированным соединением (Ч 11), Это важное свойство зонда (Ч) служит ацилирующим агентом, а не фосфорилирующим, так как это описано для аналога (1), также является характерным отличительным свойством, которое может найти полезное применение в дальнейшем. например для направленного ацилирования эминогрупп в белках и ферментах, образующих биоспецифмческие комплекгы с олигонуклеотидами.Преимущество предлагаемого нового типа соединений заключается в большей легкости его получения по сравнению с аналогом, так кэк при синтезе исключается трудоемкая и дорогостоящая стадия0 анера дорожек ферментативной реакции и выделения фосфорилировэнного олигонуклеотида.Второе важное преимущество новых соединений заключается в том, что эти соеди 5 нения, в отличие ранее описанныхзамещенных пирофосфатов, гидролитически устойчивы, что позволяет использоватьих в качестве зондов в исследованиях погибридиззционной диагностике, генотера 10 пии и аффинной модификации белков,Еще одной принципиально новой особенностью их является то, что в реакциях саминосоединениями они выступают в качестве ацилирующих, а не фосфорилирующих15 агентов, как ззмещенные пирофосфаты. Этосвойство открывает новые перспективы ихиспользования в молекулярной биологии игенной инженерии,Формула изобретения20 1, Олигонуклеотид общей формулы0ИР,10-Р-МН-СН - С- ОР,2 ц 2ОН, 025 где В 1=5 б(АССТАСС) 3;82=5 б(ТООТООТ) 3,в качестве расщепляемого зонда.2. Способ получения олигонуклеотида,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что гептануклеотид30 б(АССТАССр) обрабатывают смесью этилового эфира глицина и 1-этил-З,З -диметиламинопропилкарбодиимида в водной среде,выделяют, подщелачивэют, нейтрализуют,добавляют эквимолярное количество гепта 35 нуклеотида б(ТООТООТ) и тетрэдекануклеотида б(ТООАТООАССАССА) при рН 6 вприсутствии 0,01 - 0,3 М 1-этил-З,З -диметиламинопропилкарбодиимида,РРРУ2000300 Составитель М. ИвановскаяПавлова Техред М.Моргентал Корректор едакт Тираж ПодписноеПО "Поиск" Роспатента 3035, Москва. Ж. Раушская наб., 4/5 ка 1