Способ определения активности фенилаланингидроксилазы в биологическом материале

72) Авторы изобретен и Г.А.Анненков и Е онова Институт медицинской генетики Академии медицинских.наук СССР) Заввител СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОС ФЕНИЛАЛАНИНГИДРОКСИЛАЗЫ БИОЛОГИЧЕСКОИ ИАТЕРИАЛЕ е относ примен для диа для выя телей г%Известен способ определения активности фенилаланингидроксилазы в биоптате печени. Способ заключается в том, что биоптат гомогенизируют в растворе, содержащем 0,01 И трис 1 О гидрохлорида, 0,15 И. хлористого ка" лия, 0,01 И бета-меркаптоэтанола, рН 7,1; гомогенат центрифугируют, полученный супернатант смешивают с 0,17 щМ раствором птеридинового ко"1 фактора и 1 пй раствором фенилалани" на (соотношение белок : кофакторсубстрат 1-6:0,1:0,66), инкубируют смесь при 25 С в течение 15 мин, затем спектрофотометрически определяют количество окисленного птеридинового кофактора. Количество последнего эквивалентно содержанию новообразо(ванного тирозина и, следователь активности фенилаланингидроксил зы 11.Недостатком известного способаявляется его низкая чувствительностьи поэтому он применяется только дляопределения активности фенилаланингидроксилазы в тканях с высокой активностью этого Фермента.Цель изобретения - повышениечувствительности способа,Поставленная цель достигаетсятем, что при осуществлении способаопределения активности фенилаланингидроксилазы в биологическом матерна.ле путем его гомогенизации в растворе, содержащем трис-гидрохлорид,хлористый калий, бета-меркаптоэтанол, центрифугирования, инкубациисупернатанта с раствором птеридинового кофактора и фенилаланина ипоследующей спектрофотометрии, отли.чительной особенностью является то,что гомогенизацию проводят в при932400- 0 р 45 мЕ/мг 5 нИлка и озина эа минут П римемыши, Скорост6 см/мин, поэотсчитывают и(Онцентрация б30,0 мг/мл, ПЕ и вычисляют Форм обретения ста экстин гичесизавеличина приции эа 1 минобщий объемсмеси - 1,1объем добавлната - 0,05молярный коэтинкции длямы птеридинора - 6,45;концентрациянате в мг/млабсцисс выбсоответстной в 3 см)р реакцимл,енногомлр ФФициент экскисленной Фо вого к акт лка в го ирают интервавующие 1-й мин по оси ординат По осЬ, ие, дл 3сутствии детергента тритон-Х,инкубирование осуществляют при соотношении белок : коФактор ", субстрат как 1-6:0,8:3,3 и спектроФотометрируют на этапе постоянной ско- Зрости Ферментативной реакции,Способ осуществляется следующимобразомП р и м е р 1. В одну из кюветавтоматического анализатора скорос" 16тей Ферментативных реакций 1,КВ помещают 50 мкл гомогената лейкоцитов содержащего 152 мг/мл белка(8 ГО концентрацию определяют прямОИспектРОФОтОм 8 тРией экстинкЦии ВОДО 1;рродными связями белка при 210 нм),1 мл 0,1 И раствора трис-гидрохло-,рида, РН 7 р 4 р содержащего 5 1 й 1 Фенйлаланина. В контрольную кюв 8 ту Вносятмл 0,1 М раствора трис-гидрохлорида. После помещения кювет в приборс помощью автоматического дозаторав них добавляется по 50 мкл 0,85 Ираствора кофактора (бр-диметил"-амино-гидроксирбррв-тетрагидроптеридин) и измеряют оптическую плотность анализируемой пробы .сравнительно с холостой пробой (без субстРата) В тЕЧЕНиЕ ПЕРВЫХ ДВУХ МИНУТреакции при скорОсти протяжки бума З 6ги в регистрирующрем устройстве6 см/мин Затем проводят расчет спомощью полученной кинетической кривой, где используется ее прямолинейный участок, характеризующий постоян- Зную скорость изучаемой реакции, Рассчитывают величину оптической плотности за единицу Времени и прОизводятраст Величины удельной актвнтиФермента по Формуле 46 Отсчитывают соответствующие величины экстинкции Е и Е (размерностьв оптических единицах указана насетке на бумаге), Тогда в данномпримере могената,р 2, Гомогенат печениь движения бумагитому на оси абсциссо 6 см (отрезки Ь и Ь )елка в гомогенатероизводят расчет Е и А р 5,р 5 3 = 2,16 мЕ/мг или 2,16 нИ/мин мгбелка.Способ по изобретению позволяет повысить чувствительность определе. ния до 0,01 НИ тирозина/минрмг белка, что позволяет опредвлять активность Фенилаланингидроксилазы в лейкоцитах человека, составляющую в среднем 1 нИ тирозина/мин мг белка тогда как с помощью известного способа активность вообще не определяется, Таким образом, на этом биологическом объекте способ оказывается чувствительнее известного способа не менее чем в 100 раз, Предлагаемый способ может быть использован для определения Фенилаланингидроксилаэы в биологических материалах с низким содержанием этого Фермента. Способ определения активности Фенилаланингидроксилазы в биоло ком материале путем его гомоген ,ции в растворе, содержащем трисгидрохлорид, хлористый калий, бетамеркаптоэтанол, центриФугирования, инкубации супернатанта с растворами птеридинового кофактора и Фенилала,нина и последующей спектроФотометри о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, гомогенизацию проводят в присутствии детергента тритона 1-100, инкубирование осуществляют при соотношении белок ; коФакторсубстрат как 1-6;0,8:3,3 и спект5 93200роФотометрируют на этапе постоянной -:.скорости Ферментативной реакции.Источники инФормации,принятые во внимание при экспертизе б1. Ау 1 дщ 3., Раап К., еС а 11. А ьрес 1 Ис ИпеСЖ азьау Кот рЬепу 1 а 1 айзпе Ъудгоху 1 же. - "Апа 1 уС. В 3.ослеп", 1973, ч. У, р. 80-90. Заказ 377 Ц/6 ч Тираж 883 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", гУжгород, ул. Проектная,Составитель Р.КатосоваРедактор В.Пилипенко Техред Т,Маточка Корректор О.Билак