Способ определения протеолитической активности моющих средств, содержащих ферменты

Изобретение относится и методам оценки моющей способности мокщих средств, а именно к оценке протеолиуической активности моющих средств, и может быть использовано для оценки качествамойки оборудования, на пример, в молочной промышленности,Моющая способность является од-ной из основных характеристик моющих средств. В молочной промышленности белки, жиры и углеводы явля ются основными компонентами загрязнений. В связи с этим при оценке качества моющих средств в молочной промышленности необходимо правильно и оперативно оценить протеолити ческую активность моющих средств.О степени разложения (протеоли-: за белков судят, например, по увеличению количества растворимого азота, 20Известен способ. определения. раст воримого азота, согласно которому к 5 мл 5-ного водного раствора бепков добавляют 20 мл моющего раствора и выдерживают 2 ч при 50 С 25 После выдержки добавляют 2 мп нейтрального формалина и титруют 0,1 н. раствором МаОН до рН 9,2 в присутст 4 вии индикаторов - бромтимолового . синего и тимолфталеина. Параллель- , 30 но проводят опыт с 5 мл 5-ного вод" ного раствора белков и 20 мл.дистиллированной воды - контрольная проба. Содержание аминного азота. в процентах в пересчете на сухой 35 препарат моющего средства вычисляют по формуле 1 3.Недостаток указанного способа - наличие источника субъективных ошибок, особенно при титровании и 40 нейтрализации формалина, раствор формалина ядовит, портится при хранении, необходимо применять индикаторы или рН-метр.Наиболее близким к предлагаемому 45 по технической сущности и достигаемому результату является способ 2 определения протеолмтической активности моющих средств, согласно которому к 2,5 мл 1-ного 50 водного раствора казеииа добавляют 2,5 мл водного раствора исследуемого моющего средства, содержащего протеолитический фермент, Пробирку вцдерживают 60 мин при 40 ОС, после 55 выдержки добавляют 5 мл 0,3 М раствора трихлоруксусной кислоты, смесь перемешивают, выдерживают 15 мин при 40 С и фильтруют. Далее к 2 мп фильтрата доливают 5 мл 0,5 М раст вора углекиспого натрия и 1 мп рабочего-раствора Фолина, выдерживают 30 мин при 40 ОС и фотбметрируют против койтроля при длине волны 656-677 нм в кюветах шириной 0,5 см.; 65Ф Контроль готовят так же, только вместо 2,5 мл 1-ного раствора мою- щего средства в пробирку заливают 2,5 мп дистиллированной воды. Протеолитическую активность рассчитывают по Формуле4 7 Д+01 ПА =1000 У п где ПА - протеолитическая активность моющего средства,ед/г;Д - оптическая плотность смеси раствора,4,7 и 0,1 - постоянные коэффициенты,и - навесика моющего средства,г, в 2 мл раствора1000 - коэффициент пересчета.К недостаткам известного спОсоба относятся сложность и длительность определения, наличие множества операций, таких как подготовкарастворов реактивов с использованием тринадцати различных химическихвеществ, введение триклоруксуснойкислоты, нейтрализация гидрокарбонатом натрия, Фильтрование, термостатирование, введение реактива фолина.Цель изобретения - повышение точности, упрощение и ускорение способа определения протеолитическойактивности моющих средств.Наставленная цель достигаетсятем что согласно способу определения протеолитической активности моющих средств измеряют оптическуюплотность 0,1-10-ного водного раст-,вора молочного белка и 0,1-2,5-ного водного раствора исследуемой пробы моющего средства, смешивают укаэанные раствори в объемном соотношении 1-(4-20), подогревают смесь,выдерживают при температуре подогрева и определяют оптическую плотностьсмеси с последующим вычислением протеолитической активности мокщегосредства по формулеА щ -ф- - ф.1-ф100фгде Д - оптическая плотность водного раствора белка;Д,( - оптическая плотность вод+ного раствора моющего средства;Д - оптическая плотность смеси.2водных растворов белка имоющего средс .ва.В качестве белка используют натуральное, сгущенное, сухое цельное или обезжиренное молоко, пахту, сыворотку молочную или продукты, выделенные из иих.,1, 2 и 3составляет соответственно Д = 0,660; Д= 0,014; Д0,195, Протеолитическая активность 25 ( А) моющего средства "Биоэст",рассчитанная по формуле (1), составляет А = 72,6, что свидетельствует о высокой активности моющего.средства к белковым загрязнениям.30 Л р и м е р 2. Готовят 10 ный раствор сухого обезжиренногомолока и 1-ный раствор моющегосредства ПВильваф. В первую и третью пробирки заливают 2,5 мп раст вора белков, во вторую 2,5 мл дистиллированной воды. Далее в первую ,пробирку заливают 25 мл дистиллированной воды, а во вторую и третью 25.мп моющего раствора, Все пробир ки выдерживают при комнатной температуре 1 ч. После выдержки заливают, содержимое пробирок в кювету шириной 1 см и определяют оптическуюплотность при длине световой волны 45 .500 нм на спектрофотометре. Опти.ческая плотность растворов иэ про55 65,Сущность способа заключается в том, что оптическая плотность раствора молочных белков при действии моющих средств снижается, Это снижение вызвано измейением нативного состояния белков врезультате их протеолиза, т,е. набухания и расщепления. Оптическая плотность раствора молочных белков снижается под действием моющего средства в диапазоне световых волн в интервале 20-700 нм. установлено, что снижение оптической плотности раствора белков при одинаковых условиях (тем;пература, концентрация моющего раст-:вора и время. выдержки)бывает разным для моющих средств различного:состава. В связи с этим в стандарт-.ных условиях возможно сравнить моющую способность моющих средств по отношению к белковым загрязнениям.Способ осуществляют следующимобразом.Приготавливают водный раствормолочных белков, который содержит0,1-10 белка, В качестве белковиспользуют натуральное, сгущенное,сухое цельное или обезжиренное молоно, пахту, сыворотку.молочную или, белки, выделенные из иих. Приготавливают водный раствор мокщего средства концентрацией 0,1-2,5В три пробирки заливают одинаковые объемы, раствора белков или дистиллированной .:воды, в первую .и третью - раствор белков,.а во вторую - соответствун- , щее количество воды. Потом заливает в первую пробирку 4-20 объемов (по отношению к объему раствора белков) дистиллированной воды, а во вторую и третью - водного раствора моющего средствва, подогретого до 20-90 фС, и перемешивают, Третью пробирку вь- держивают от 10 мин до 2,0 ч при , . постоянной температуре (20.-90 С). Далее определяют оптическую плотность растворов при длине волны ( 31 )200-700 нм в кювете шириной, преимущественно, 1 см с помощью спектраФотометра или Фотокалориметра, Привысокой плотности одного из исследуе:ьыс растворов (более 1,0,) все пробирки разбавляют 1-.10 объемами дистиллированной воды к одному объемусмеси иэ каждой пробирки. Протеолитическую активность моющегосредства вычисляют по Формуле (1 ),Моющее средство является неактивным по отношению к белкам, еслиего.протеолитическая активность,рассчитанная по форМуле, равнанулю, и идеально активным, еслиприближается к 100. П р и м е р 1., Готовят 5-ный водный раствор сывороточных белков. Сывороточные белки выделены иэ сыворотки ультрафильтрацией и высушены. Готовят 1-ный водный раствор моющего средства "Биоэст". Готовят три пробирки, в первую и третью иэ них заливают по 5 мл раствора белков во вторую 5 мл дистиллированной воды. Далее заливают в первую пробирку 20 мл дистиллированнойводы, а во вторую и третью - по 20 мп моющего раствора, подогретого до 50 С, Третью пробирку выдерживают в термостате 2 ч при 5 ООС.После выдержки берут из 1-3-ей пробирок по 5 мл смеси, которую вливают в новые пробирки 1, 2, 3 .залитые 20 мл дистиллированной воды. Содержимое пробирок 14, 2 и 3 вымешивают, заливают в кювету шириной 1 см и определяют оптическую плотность при длине световой волны бирки 1, 2, 3 составляет соответственно Д, = 0,96; Д = 0,000; Д = 0,097, Протеолитическая активность, моющего средства фВильва", рассчитанная по формуле, составляет А = 89,9, что свидетельствует о высокой активности моющего средства к белковым загрязнениям обезжиренного молокаП р и м е р 3. Берут сгущенное обезжиренное молоко с .содержанием 20 сухих веществ и готовят 2,5-ный водный раствор моющего средства "Вимол". Готовят три колбы Эрленмеера объемом 50 мл. В первую и третью колбы заливают 1 мл сгущеннго обезжиренного молока, а во вторую 1 мл дистиллированной воды, потом в первую колбу.заливают 20 мл дистиллированной воды, а во вторуюи третью - по 20 мл моющего раствора, подогретого до 80 С. Третью колбу выдерживают 15 мин при 80 С. После ныдержки но все колбы заливают по 20 мл дистиллированной воды. Содержимое колб перемешивают, заливают н кюветы шириной 0,5 см и определяют оптическую плотность при длине световой волны 700 нм на фотокалориметре, Оптическая плотность растг ров из колб 1, 2 и 3 10 составляет соответственно Д е = 0,87, Д= 0,02; Д 2= 0,59. Протеолитическая активность (А) раствора моющего средства "Вимол", рассчитанная по формуле, составляет А = 34,5, 15 что свидетельствует о средней протеолитической активности указанного средства к белковым загрязнениям.П р и м е р 4. Готовят 0,1-ный водный раствор цельного молока и 2 О 0,1-ный водный раствор моющего средства "Триас-А". Готовят. три конические колбы, н первую и третью колбы заливают по 25 мл водного раствора цельного молока, а но вторую 25 мл 25 дистиллированной воды. Потом в первую колбу заливают 25 мп дистиллированной воды, а но вторую и третью - по 25 мл моющего раствора, подогретого до 90 С. Третью кол О бу выдерживают 5 мин при 90 С. После выдержки. и охлаждения содержание пробирок заливают н кюветы шириной 1,0 см и определяют оптическую плотность при длине световой Зу волны 210 нм на спектрофотометре. Оптическая плотность раствора иэ колб 1, 2 и 3 составляет соответственно Д= 0,418; Д= 0,01, Д 2 = 0,384. Протеолитическая активность 0,1-но О го раствора моющего средства "Три-, ас-А", расчитанная по Формуле, составляет А,37, что свидетельствует о низкой протеолитической активности укаэанного средства в данных 45 условиях к белковым загрязнениям.Для сравнения с известными способами: методом определения растворимого азота в казеине (метод Зерейсена-Гаврилова) 113 и методом определения протеолитической активности ферментов в моющих средствах (метод "ФОЛП") 2) проводят испытания,.1. Пр ед ла га ем нй сп ос об. Го- у товят три пробирки. Впервую итретью пробирки заливаютпо 5 мл 5-ноговодного раствора сывороточных белков,во вторую 5 мл дистиллированной воды. Далее в первую пробирку вали- овают 20 мл дистиллированной воды,а во вторую и третъю 20 мп 2,0-но.го водного раствора моющего средства, подогретого до температуры выдержки. Пробирки перемешивают,Третью пробирку со смесью нодных растворон белков и моющего средства выдерживают 2 ч н термостате, После выдержки берут еще три пробирки 1, 2, 3, н которые заливают 5 мл соответстзующих растворов и 20 мл дистиллированной воды. Оптическую плотность определяют при длине волны 3 = 600 нм в кювете шириной 1 см на спектрофотометре фБресо 1" (ГДР). Протеолитическую активность в процентах вычисляют по формулеА = -(- 100+Д 1-ДДогде А - протеолитическая активностьмоющего средства, :Д - оптическая плотность нодОного раствора белков,Д - оптическая плотность вод 1ного раствора моющего средстна,;Д - оптическая плотность смеси2водных растворов белкови моющего средства.2, Определение протеолитическойактивности ферментов н моющем средстве по методу фФОЛП" Г 2 3.До начала определения готбвятследующие растворы: карбонатный буферный раствор, раствор каэеина,раствор трихлоруксусной кислоты,раствор натрия углекислого, реактивфолина.На приготовление растворов используют реактивы тринадцати наименований. Затраты времени на подготовку реактивов 16 ч. Стоимость реактивов на 100 определений1,15 руб.Готовят две пробирки. В первую пробирку заливают 2,5 мл .дистиллированной воды, во вторую 2,5 мл водного раствора белков. Далее н обе пробирки добавляют 10 мл 2,0-ного водного раствора моющего средства и выдерживают 2 ч при 50 ОС. После выдержки добавляют 5 мл 0,3 И водного раствора трихлоруксусной кислоты и выдерживают 15 мин при 50 С. Далее берут две новые пробирки, воронки, фильтровальную бумагу и фильтруют н течение 1 ч. Во время фильтрования готовят разбавленный раствор Фолина, После фильтрования берут еще 2 чистые пробирки, заливают 2 мл Фильтрата, 5 мл 0,5 М раствора углекислого натрия и 1 мл рабочего раствора фолина, Смесь выдерживают 30 мйн при 50 С. После выдержки охлаждают пробирки до 20 С в водяной бане в течение 15 мин и измеряют оптическую плотность против контроля при длине волны1.06574 Й Таблица 1 Протеолитическая активность моющего средства по методу ФОЛП д/г Протеолитическая активность"; моющего средства по пред-лагаемому способурРастворимый азот по методу Зерейсена-гаврилова,Наимечование Фермента,входящего в состав моющей композиции "БИОРУМ Раствор молочных белковнь воце 0,00 0,00 0,96 Раствор молочных белковна моЮщем средстве безфермента 1,75 46,16 76,83 ,72,96 62,29 68,84 75,83 13,7 Панкреатин медицинский 4 , 2.7 355,2 298,9 3,10 Протосубтилин ГЗХ 301,4 152,0 306,3 2,98 Нротосубтилин Г 10 Х 2,28 Протогидролитин 2,87 Трипсин (Датский) Трипсин кристаллический(ЧССР) 75,25 52,11 350,3 2, 69. 32,1 2,14 Гликозидаза 630 нм, ширине кюветы 1,0 см на объем 0,1 н, раствора ч .оп,спектрофотометре Ыресо 1,. Протео- иэрас:одованный на титровалитическую активность вычисляют по ние контрольного образформуле ца после устаноьленияПА = 4 с 7 Д + Ос 1 , 1000нейтральной средя,и0,0014 - количество аэота, соотгде ПА - протеолитическая активность,вет тв ющее 1 мл 0 1 нед/ед граствора Иа,ОН, г;100 100- коэФфициенты для пересчетаД - оптическая плотность4,7 и 0,1 - постоянные коэффициенты,и - количество моющего средстС - количество раствора белков,ва, мг, в 2 мл реакционнойсреды1000 - ковффйтиент персчетамгвч,- содержание воды в растворе3. Метод Зерейсена-Гаврилова оп- , белков, .ределения растворимого,азота 11Готовят две пробирки, в которые 15 Результаты сравнения трех метозаливают по 5 мл 5-ного водного. дов представлены в табл. 1.раствора белков, В первую заливают20 мл дистиллированной воды, а во По данным табл, 1,установлено,. вторую 20 мл моющего раствора. Оба . : что между протеолитической активобразца выдерживают 2 ч при 50 фС. 20 ностью моющих средств, определейнойПосле выдержки дОбавляют по 2 млпредлагаемым способом (А), протеолинейтрального формалина и титруют - тической активностью моющего средв стакане 0,1 н. БаОН дО рН 92. СО- ства, определенной .по методу ФОЛПдержание аминного азота в процентах (Б), и растворииал азотом, опрев пересчете на сухой прЕпарат вы деленным по методу Зерейсена-Гавричисляют по формуле; лова (В), существует тесная прямаяС(Ч-Ъ ) Од 0014100 100 ( корреляционная зависимость. Опре(100-У , . делены следующие коэффициенты. где Х - содержание аминйого азота, ;корреляции: АБ0,9163 досточ - объем 0,1 н, раствора БаОН, 30,верность о критерию Стьюдентаизрасходованный на титро; АВ = 0,6629 достоверностьванне анализа после установ,9; БВ = 0,7792 достоверления нейтральной среды, . ность 99,9.1065742 Далее проводят испытания предлаГаемого .способа при исследовании различных моющих средств. кроме того, изменяют различные параметры проТаблица 2 Раствор моющего средстваСЕ- Раствор молочных белков Й Условия выСоотношение ксйтичеств растворовсмеси,держки сме- си Источник белк 4Наиме- Конценнова- трация, ние Ъ тов Темпе- Времяратура ч,С мин Раствор моющего средст- ва Раствормолочныхбелков Натуральное цельное молоко1,0 3,0 ва3,0 5,2 50 5,0 0,1 фтриас-Аф"Биоэстф 3 0 5,0 2 м Концентрациясухихвеществв растворе,Кон- цен- трация белка в ра- створе, Ъ ведения опыта с целью определенияграниц его применения.В табл, 2 представлены результатыисследований.12 1065742 Продолжение табл. 2 Оптическая плотность Разведение перед определением оптической плотности, мл Дл;на световой волны,нм Серияопытов смеси раст.вора белков с эквива; лентным количеством дистиллированной воды (пустая . проба) Дз Смесь раст воровбелка имоющегосредства Дистиллирован- ная во- да 600. 1,600 310 1,250310 0,775: 31,87 0,00 1,09 20 30,40 0,87 0,00 20 20,13 0,619 0,00 520 1,02520 Оф 960 0,096 0,00 0,097 0,00 90,58 89,89,20 520 О,530 10 600 0,732 0,033 0,00 0,048 0,00 0,065 0,00 93,77 93,44 93,80 92,75 20 520 1 у 050Ф20 . 600 0,690 0,050 0,00 520 . 0,106 600 О 660 0,040 .0,00 0,260 0,00 0,266. . 0,00 0,272 0,00 0,195 0,014 20 20,600 0,660 600 0,660.600 0,660 20 5 20 гпараметры возможно менять с целью сокращения длительности определения.Оптимальным является нгпользование сывороточных белков молока, прн менение 5-ного водного растворабелков, разбавление четырехкратным количеством перед определением оптической плотности, определение оптической плотности при длине волны 6 О 3 = 600 нм. Другие параметры следует стандартизировать в зависимости от целей определения. Длительность одного анализа при65 осуществлении предлагаемого спосоПроведенные исследования показали, что предлагаемый способ являет. ся чувспвительным при указанных параметрах определения, при этомвозможно применять различные белковые продукты молочного происхождения, В табл. 2 каждую серию опытов следует рассматривать раздельно. Иэ табл. 2 видно, что протеолитическая активность моющих средств в большей степени проявляетвя на сухом и сгущенном обезжиренном молоке, в котором основное количество белков составляет каэеин. Температура, время выдержки и другие смеси раствора белков и моющегосредства,моющего средства сэквивалентным количеством воды,Ду Протеолитическая активнбсть моющего средстваДо+Д-Я 1.Д х 100,1065742 13 Составитель Л. РусановаРедактор Л. Филь Техред О.НецЕ КорректорМ. Шарошимвее щНВВСаееЗаказ 11033/44 Тираж 828 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патентф, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ба 2 ч.30 мнн. По методу "ФОЛП" длительность одного анализа 5 ч 15 мин.Таким образом, использование предлагаемого способа определения протеолитической активности моющих средств по сравнению с известными способами позволяет понысить точность определения в связи с меньшим количеством операций и исключениемопераций, требующих субъективногоопределения, требует меньше материальных затрат, при этом сокращается продолжительность определенияв результате отсутствия операцийподготовки химреактивов, фильтрования и повторного термостатирования.