Способ получения ридулозодифосфаткарбоксилазы-оксигеназы

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИ ЕТЕЛЬСТВУ Севэ Севетскик Социалистических Ресвублик(22) Заявлвмо 090877 (21) 2528758/23-04с присоединением заявки Йо Государственный комитет СССР ио яелам изобретений и открытий( 088, 8) Дата опубликования оттмсаиия 15.10.79(72 Авторы изобретения Н.Г.Доман, Т.А.Сеитова и Н,Г.Русинова 34 71) Заявитель биохимии им, А.Н.Баха АН С исти 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБУЛОЗОДИФОСФАТКАРБОКСИЛАЗЫ ОКСИГЕНАЗЫ 2 1Изобретение относится к области биохимии и медицины, а именно к способу получения высокоочищенных ферментных препаратов, конкретно к способу очистки рибулозодифосфаткарбоксилазы-оксигеназы, Настоящий способ может быть использован в производстве ферментных препаратов для научных исследований.10Рибулозодифосфаткарбоксилаэа (3-фосфо"Э-глицерат-карбокси-лиаза, димеризующая, КФ 4,1.1. 39) является ключевым ферментом восстановительного пентоэофосфатного цикла и катализирует в процессе фото- и хемосинтеэа образование 2 молей фосфоглицериновой кислоты иэ 1 моля СО и 1 моля Э-рибулоэо,5-дифосфата.Рибулозодифосфаткарбоксилазаоксигеназа заключена в листьях высших растений в виде растворимого белка, составляющего 30-40 всех других растворимых белков растения,Считалось, что этот фермент обладает лишь функцией карбоксилирования, Однако в 1973 г, была обнаружена вторая его функция - оксигеназная, Рибулозодифосфатоксигенаэа каталиэирует йеобратимое окисление рибулозодифосфата до 2-фосфогликолевой кислоты и 3-фосфоглицериновой кислоты, Отделение рибулоэодифосфаткарбоксилаэы от рибулоэодифосфатоксигеназы оказалось безуспешным; зтослужит доказательством того, чтоодин и тот же фермент катализируетобе реакции 1,В литературе описан ряд способовочистки рибулозодифосфаткарбоксила"зы из автотрофных организмов; растений, водорослей, микроорганизмов 2,Эти способы предусматривают использование дорогостоящих приборов иреактивов, таких как скоростнаяцентрифуга для зонального градиента сахарозы, установка Аюсопсефароэа, ДЭАЭ-целлюлоза, ДЭАЭ-сеадекс и т.д.Известен также способ очисткирибулозодифосфаткарбоксилазы иэшпината 31. Этот способ включаетследующие операции,1, Гомогениэация сырья в буферес рН 7 4,2. Выделение хлоропластов иэлистьев шпината дифференциальнымцентрифугированием в изотоническомрастворе сахароэы,3. Получение экстракта белка извыделенных хлоропластов после ихразрушения,4, Очистка фермента.из экстрактапосредством Фракционироваиия сульфатом аммония, диализа и двухкратнойхроматографии на сефадексе 6 в .200., Недостатком известного способа. является невысокий выход целевогопродукта. Процесс выделения рибулозодифосфаткарбоксилазы требует боль.:Шого "количества листовой биомассы,многостадиен, сложен для воспроиз.ведения технологической стадии выделения хлоропластов, В результате;получают фермент только лишь с карбоксилазной функцией и невысокойудельной активностью,Целью опйсываеМого способа .являЕтся разработка метода одновременного получений фермента с 2 кагалитическими Функцйями - рибулозодифосфаткарбоксилазной и рибулозо.дифосфатоксигеназйой - в одномтехнологическомпроцессе с повышеннОй.активностью фермента и уве.яйчфным вЫходоМ готового продуктанздейевого и доступного сырьяволосйеца ситникового, Указанная."цель"достигае)тся за счет того, чтодля"получения целевого йрадуктаис)1 одъэуют в .качестве сырья волос йец ситннковый) сОдЕржаший РибулозодиФосфаткарбо(ксилазу-оксигенаэу, и предлагаемую. комбинацию стадий Очистки рибулозодифосфаткарбоксияазы-оксигенаэы в сочетании соследуюабщй условйями проведениястадий очистки.1.,ГомогениэаЦиЮ сирья ПроВодятв. буфере с рН 8-8,2.2, Очистка .рибулозодифосфаткар-боКсйлазыоксигеназы осуществляется йоследовательнЬ 1 йи стадиями:а) гель-филътрацией экстракта излистьев через сефадекс 6 -50;б) обработкой экстракта сульфатомстрептомицина; в) фракционированием экстракта сульфатом аммония;г) обессоливанием на сефадексе3 - 50; д) гель-фильтрацией на сефадексе б,Согласно изобретению описывается упрощенный процесс получениярибуЪозодифосфаткарбоксилазы-оксигеназы (КФ 4.1,1,39) из автотрофныхорганизмов с высоким выходбм целевого продукта с двумя каталитическими Функциями из волоснеца (ломксфолосник) ситникового Еймецз (рваЮМоМасйу) отсею ) заключающийся в получении гомогената изсырья В буфере с рН 8,0-8,2 и последующем выделении фермента последовательными стадиями: а) гельФильтрацией экстракта на сефадексе.5 " 50; б) обработкой сульфатомстрептомицина; в) фракционированием, 60 65 Полученную темно-зеленую массу фильтруют через полотно, затем центрнфугируют в течение 40.мин при 23000, . Для более полного выде-ления растворимых белков осадок два раза промывают исходным буфером. После первого промывания осадка дополнительно извлекают 5-6% белка,сульфатом аммония; г) обессоливанием на сефадексе 6-50; д) гельфильтрацией на сефадексе б -200,Предпочтительно процесс проводят следующим образом;Все операции по очистке фермента проводят на холоду, Листья волоснеца ситникового гомогениэируютв буферной смеси следующего состава: трис-НСЕ 0,05 М, рн 8,О,2;30 МаСЯ .0,2 М) Эдтъ 0,005 Мр МС 8)0,01 М;дитиотреитол 0,01 М. Гомогенат подвергают центрифугированию при 23000в течение 30-40 мин, Далее с цельюосвобождения белка от низкомолекулярных прймесей проводят гель-фильтрацию полученного экстракта черезколонку с сефадексом 6-50, уравновешенную тем же буферОМ, в котоРомпроводили гомогениэацию. Далее) сцелью удаления нуклеиновых кислот)белковуЮ фракЦиЮ обрабатывают свежеприготовленным 10-нйм растворомсульфата стрецтощщина) который добавляют по юа)пляж:до ке)оечной концентрации 3 Л Осадрк".Удаляют центрифугировайиж и Ьищосадочную жидкость подвер)гавот фракцйони)рованиюсульфатомаммония. Фракцию, полученную в пр)едЮах 36"44 н)асцщения)центрнфугируют), осадок растворяютв минимальнойколйчестве буфера следу)ощего состава: трис-НСС О,025 М)рН 8,0-8)21 Май О,:1 М; ЭДТА0,005 М; ЩСВ. 0,01 Й; дитнотреитол0,01 М, Расгзоробесссдщвают на 35 колонке с сефацексбм 6-50, уравновешенной тем же буфе 1.:ЮМ. Конечнуюстадию очистки проводят,ПОсредствомхроматографий обесссленной б);лковрйфракции иа сефадексеб) урав новешенном тбй же буферной системой,в которой проводят обес."солйвание,Фракции, содержащйе фермент, объединяют. Получают гомогенный препарат фермента, который можно хранитьв замороженном или лифилизованномсостоянии.Волоснец ситниковый выращиваютв оранжерее на почве или в воднойкультуре на смеси Прянишникова,Навеску листьев (120 г) 3-недельныхпроростков волоснеца ситниковогогомогенизируют в кратном объеметрио-НС).-буфера (рН 8,1) низкойионной силы (0,05 М), содержащего0,2 М хлористый натрий, 0,005 МЭДТА) 0)01 М хлористый магний, 0,01 Мдитиотреитол.после второго 1-2 белка от исходного.Надосадочную жидкость (экстрактиз листьев), содержащую растворимыебелки листа, далее подвергают очистке от нйэкомолекулярных веществ не-белковой природы путем фильтрованиячерез колонку (100 х 4,0 см) с сефадексом 8- 50, уравновешенную буфером, в котором проводят разрушениелистьев. В результате Фильтрациигомогената через сефадекс 0-50выделяют два компонента, Все раствориМые белки элюируются в составе первого компонента,Для удаления нуклеиновых кислотк белковой фракции, полученной после Фильтрования на сефадексе 6-50,постепенно пэ каплям добавляют10-ный (свежеприготовленный) сульфат стрептОмицина до кОнечнОй кОНцентрации осадителя 1. Сульфатстрептомицина готовят в буфере, который используют для получения экст-ракта Из листьев волоснеца ситникового. Через 30 мин ОСадок отделяютцентрифугированием в течение 20 мин 25при 16000 с 1,. Осадок отбрасывают,а надосадочную жидкость используютдля Фракционирования белков сульфатом аммония.30Перекристаллизованный и растертый в порошок сульфат аммония добавляют к белковому раствору до 36насыщения (количество сульфата аммония рассчитывают по номограмме), З 5выдерживают 60 мин и центрифугируют20 мин при 16000, Далее такимже образом получают фракцию белкав пределах 36-44 насыщения и после центрифугирования для . удаления 40сульфата аммония из Ферментногопрепарата осадок белков растворяютв минимальном объеме (2 мл) 0,025 Мтрис-НСВ -буфера (РН 8,0), содержащего 0,1 М хлористым натрий, 0,005 М 45ЭДТА, 0,01 М хлористый магний, 0,01 Мдитиотреитол, и фильтруют через колонку (25 х 1,2 см) с сефадексомЬ, уравйовешенную тем же буферомр со скорОстью Ор 1 мл/мин. Белковые Фракции собирают,Обессоленный на колонке с сефадексом 6-50 белковый раствор в количестве 3 мл (200 мг белка) наслаивают на колонку (100 х 2,2 см) с 55сефадексом 8-200, уравновешеннуютем же буфером, которым проводилиобессоливание. Элюирование белковс колонки проводят со скоростью0,1 мл/мин, Фракции по 2 мл соби"рают при помощи автоматического 60коллектора фракций, фракции 35-44 сферментативной активностью объединяют. Фермент хранят при 00 С, илиов замороженном состоянии при -20 С,или высушивают лиофильно, Табл, 165 иллюстрирует описанный пример выделения фермента,В табл. 2 дана характеристикаферментных препаратов в процессехранения,Свежеполученная рибулозодифосФаткарбоксилаза в 0,025 М трис-ЯСЙ --буФере (РН 8,0), содержащем 0,1 Мхлористый натрий, 0,005 МЭДТА,0,01 М хлористый магний и 0,01 дитиотреитол была стабильна в тече 1о оние 3-4 недель при 0 С и при -20 Св течение 5-6 месяцев, ЛиоФильновысушенную рибулоэодифосфаткарбококсилазу можно хранить при -20 С втечение 6 месяцев,Рибулозодифосфатоксигенаэа в0,025 М трис-НСС-буФере (РН 8,0),содержащем 0,1 М хлористый натрий,0,005 И ЭДТА, 0,01 М хлористый магний и 0,01 М дитиотреитол, при хранении в течение полугода при -20 Стеряет первоначальную активность.Однако нагревание фермента в присутствии 50 мМ хлористого магнияи 0,1 И дитиотреитола при 50 С втечение 5 мин восстанавливаетисходную активность,Состав Ферментной смеси для определения активности рибулозодифосфаткарбоксилазы (мкмоль/мл); хлористыймагний 10,0; дитиотреитол 10,0;ИаНС О 50,0 в 0,05 М трис-НСРбуфере (РН 8,1)р рибулозо,5-дифосфат 0,5; рибулозодифосфаткарбоксилаза не более 0,05-0,1 мг белка,контролем служит также реакционнаясмесь, но без рибулозо,5-ДифосФата,Состав ферментной смЕСи для определения активности рибулоэодифосфатоксигеназы на полярографе ЛП(мкмоль/мл): хлористый магний 10,0;дитиотреитол 0,4 1 Рибулоэо,5-диФосфат 1,2; рибулозодйфосфатоксигенаэа 0,71 мг; трис-НСС-буфер (РН9,3-200,0)Одна единица рибулозодифосфаткарбоксилаэы карбоксилирует 1 мкмольрибулоэодифосфата до 2 мкмоль фосфоглицериновой кислоты при 30 С в1 мин.Одна единица рибулоэодифосфатоксигенаэы оксигенирует 1 мкмоль рибулозодифосфата до 1 мкмоль фосфогликолята и 1 мкмоль фосфоглицерата при30 С в 1 минГомогенность выделенной рибулозодифосфаткарбоксилазы-оксигенаэы доказана следующими методами: 1) седиментационного равновесия на аналитической ультрацентрифуге 9 р 1 псОмодель Е; в малом слое с применениемтеневой оптики; 2) при электрофореэе в 7,5-ном полиакриламидном геле; 3) с помощью электронной мнкроскопии негативно окрашенного препарата.,160 10,3 100,0 моген из листьев Сефадекс 21. 164,8,50 ица Ко тв фе ента 40 2,45-2,55 нный о ныйри е орож ения 90,0 80,0 2,20-20,50 е нны нный после при -20 С орожени.Формула изобретенияСпособ получения рибулоэ фаткарбоксилазы-оксигенаэы .1.39) иэ автотрофных орга включающий гомогенизацию с дни очистки: фракционирова фатом аммония и гель-фильт сефадексах,. о т л и ч а ю тем, что, с целью получени та с двумя каталитнческими ьы, упрощения процесса и у ния выхода целевого продук честве автотрофного органи поЛьзуют листья волоснеца колосник) ситникового Бвц ьфЬасЬъэ)ф 3 псе 09эацйю сырья проводят в буф .8,0-8,2 с последующей очис ильтрации ботки сул акционирообессол 50 и гель се 6-оо путем гельЭобр томицина, ф атом аммони фадексе 8 и на сефаде могената сефадекс том стре 45 ния сульфния на се фйльтраци н одифос(КФ 4. 1,ниэмов,ырья и стание суль"рацию нащи й с яя фермен- функциявеличета, в казма ис(ломко 9(рэаСМчгомогениере с рНткой го-. Источники инф принятые во внимание(, АпдГеччв Т,Ьо 1 юЕ Юоэе ЭрйоврЬаСе охчепа рйодйсоВаСе Ьч ЕгасСоп фВоспетИСгз,"1973,Я, й,2,Апдегэоп (.Е, ЮЬцВ сагбохЕаве Югом 3 гцЬ то Р оЭЧ Ф 2 РагЬс, 1 975 З.тгощп Р,%Ап 4 врг Салоп оЮ сагЪохМ 19 тта 1969, 4 Ме 9,908 (прототе 6 Тираж 51 НИИПИ Заказ 6 19 одписн Филиал ППП Патент ектная,4,ород, ул Насыщение (ЙН 4 0,36-0)44