Способ ингибирования синтеза рибосомных рнк

.Абдуллаев, Н.Х.Мехти Научный центр биологических исследований АН Азербайджанской ССР) Заявитель 54 ) СПОСОБ.ИНГИБИРОВАНИЯ СИНТЕЗА РИБЬСОИН еостигается тем, ирования синтез и инкубирования Изобретение относится к молекуляр. ной биологии и генетике, касается техники ингибирования синтеза рибосомных РНК и может быть использовано в качестве тест-метода для изучения синтеза рибонуклеиновых кислот в клетках высших организмов.Известен способ ингибирования синтеза рибосомных РНК путем инкубирования биологического материала с1 раствором селенита натрия 1.Однако известный способ применим лишь для ингибирования активности А-формы Фермента только в системе 4 бесклеточного синтеза.Для опытов л ч 1 чо в литературе способы ингибирования синтеза рибосомных РНК неизвестны,Цель изобретения - ингибирование синтеза рибосомных РНК в нативных клетках.Указанная цель дчто в способе ингиб а рибосомных РНК путе биологического материала с раствором селенита натрия интактные бластодермы отделяют от желтка, инкубируют с селенитом натрия, затем добавляют в инкубационную смесь Н 3-урдин в концентрации 40-50 мк Ки/мл,отмывают от невключившейся метки,добавляют РНК-носитель, уридин иконтролируют степень ингибярованияопределением фракции РНК-ДНК,Способ осуществляют следующимобразом,Оплодотворяют зрелую икру, опрделяют стадии развития по Нейфаху,отделяют интактную бластодерму отжелтка, инкубируют с 10-40 щМ селенита натрия, охлаждают, добавляюттрихлоруксусную кислоту (ТХУ) и из"меряют радиоактивность.Инкубацию проводят после отделения бластодермы от желтка в присут"ствии антибиотиков, В инкубационнуюсмесь добавляют смесь Н -уридин вконцентрации 40-50 мк Ки/мл, отмы3 9323вают от невклюцившейся метки, добавляют РНК-,носитель 0,1 мл (5 мг/мл)немеценный уридин 0,1 мл (10 мг/мл)и контролируют степень ингибирования определением фракции РНК-ДНК 3методом Шмидта-Таннгаузера.П р и м е р .1. Каждой из 20 самок вьюна инъецируют 1 мл гонатропина с концентрацией 5000 ед., после36-цасовой инкубации при 170 С икра 10созревает, ее выделяют у самок и у1 О самцов сперму, В полученную икрув чашках Петри добавляют суспензиювыделенной у 10 самцов спермы, в течение 5 с перемешивают в присутствии 1 з10 мл дехлорированной водопроводнойводы и оставляют на 5 мин. Оплодо-,творенную икру промывают водой дополного удаления полостной жидкостииз спермы, Затем помещают в чашки р 0Петри, заливают 200 мл воды, содержащей 100 ед./мл пенициллина и стрептомицина 50 ед,/мл. Инкубацию оплодотворенной икры проводят при 21 С,Под микроскопом по методу Нейфаха 25определяют 10-тичасовую стадию развития. Отделяют зародыши (бластодермы) от желтка, снацала промываядля разрушения оболочек зародышейв 200 мл 0,53-ного раствора трипсина зв течение 7 мин, затем .неоднократнопромывая зародыши раствором Гольфретера,ЗатеМ отделенные зародыши помещаютв 9 пробирок, заливают буфером Гольф-Зфретера двойной концентрации на0,05 1 г 15-НС 1 буфере рН 7,6, в присутствии 100 ед,/мл пенициллина,50 ед,/мл стрептомицина до достижения уровня 1 мл. Переносят пробирки в ледяную баню на 5 мин. В каждуюпробирку добавляют Н -уридин из расчета 40-50 мк Ки/мл, встряхиваютнесколько раз и оставляют в ледянойбане на 10 мин для отстаивания,В 4-ю, 5-ю, 6-ю пробирки добавляютселенит натрия до конечной концентрации 4 ммоль, в 7-ю, 8-ю, 9-ю пробирки добавляют селенит натрия доконечной концентрации 40 щмоль. Переносят все пробирки в. водяную банюпри 210 С и инкубируют в течение 1 ч.После инкубации в каждую пробиркудобавляют 3 мл раствора Гольфретерапри 0 С для остановки реакции, тща- Ыотельно перемешивают содержимое пробирки и осторожно отсасывают раствордо уровня 1 мл. Процедуру повторяют 99 ф три раза для полного удаления невключающейся метки. В каждую пробиркудобавляют по 1 мл раствора Гольфретера и замораживают в бане (сухойлед+ацетон), дают возможность оттаятьв лебяной бане, затем добавляют вкаждую пробирку 1 каплю РНК-носителя с концентрацией 5 мг/мл, затемв каждую пробирку добавляют по20 мкл раствора немеценного уридина(10 мг/мл). Дальнейшую обработкуполученной смеси для количественногоопределения РНК проводят по методуШмидта-Таннгаузера, для чего в каждую пробирку добавляют 503 ТХУ доконечной концентрации 1 Ог, гомогенезируют стеклянным пестиком, затемцентрифугируют при 4000 об/мин10 мин. Надосадочную жидкость (кислоторастворимая фракция) переливаютв отдельные пробирки, подвергаютанализу по методу 1 ъез и др. Осадок высушивают и проводят гидролиз следующим образом.В каждую пробирку вливают по 2 мл 0,5 Н МаСН, осторожно размешивают, проводят инкубацию в течение 2 ч. Пробирки после гидролиза переносят в ледяную баню, добавляют 50/ ТХУ до концентрации 10/, в осадок при этом выпадают ДНК-белки, а в растворе остаются рибонуклеотиды РНК. Растворы центрифугируют при 4000 об/мин. Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость обрабатывают эфиром до рН 7 и измеряют радиоак- тивность на сцинтилляционном счетчике (Я,-ЗО 1 пйегйесйпЖ, Гтапсе) .По включению метки в РНК судят. об интенсивности синтеза РНК. Устанавливают, что ингибирование синтеза РНК на этой стадии не происходит. Далее об относительной интенсивности синтеза РНК в зародышах на различных стадиях развития судят по включению Н -уридина в тотальную РНК с учетом внедрения метки в суммарную кислоторастворимую фракцию и в ФосФорилированные производные уридина,П р и м е р ы 2-5. Процесс проводят, как описано в примере 1, но рассматривают 11,16,17,18-часовые стадии развития зародышей, Степень ингибирования соответственно составляет 27,2, 21,3, 53,4 и 72,5 Ф, т.е, возрастает.В табл 1 приведены результаты исследований действия селенита натТаблица 1 Стадии раз- Вариант опыта Включениевития, ч (пМ Иа ЯО) метки вРНК Степень ин-. гибирования,о+40 2,0 90 4,0 17-18 Контроль 4,0 220 14 72 5 5 9323 рия на синтез РНК в зародышах вьюна на различных стадиях развития по предлагаемому способу и известному способу (контроль) при времени инкубации 60 мин, %Данные табл. 1 показывают, цто угнетение селенитом натрия (40 Ф) синтеза РНК в основном происходит на стадии развития 11-18 ч, когда во всех зародышах, преимущественно, О происходит синтез рибосомных РНК,доза вещества в 4 щМ по сравнению с системой ш ч 1 йго в опытах ш что неэффективна, что связано со сложной системой клеточных барьеров прони цаемости.В табл. 2 приведены результаты действия различных концентраций селенита натрия на синтез РНК в зародышах вьюна л ч 1 чо на стадии гаструлы 20 при времени инкубации 60 мин.Данные табл, 2 показывают, что, начиная с 1 О пФ 1, селенит натрия ингибирует включение метки в РНК, Наи 99 6более сильное ингибирование отмечено при действии 40 п 1 селенита натрия,Таким образом, в отличие от известного свойства селенита натрия ингибировать активность А-формы ДНК- зависимой РНК-полимеразы в системе бесклеточного синтеза РНК,предлагаемый способ позволяет ингибировать селенитом натрия в концентрациях 1 О пй синтез рибосомных РНК в эмбриональных клетках зародышей вьюна на стадии гаструлы. Преимуществом предлагаемого способа является то, что он позволяетингибировать синтез рибосомных РНКЫ что, т,е в живом организме,что делает возможным изучение полного цикла синтеза рибосомных РНК ввысших организмах, что ведет к болееглубокому пониманию процессов гене,тического аппарата в эукариотических1 клетках,932399 Табли ца 2 Включение метки,отнесенное к включениюметки в свободныенуклеотиды Количество Включение меткив РНК зародышейимпульс/мин Степень ингибирования синтеза РНК Ж.селенита натрия, ий 3408 4,8 4,8 2160 10 25 41 20 2,8 972 2,6 40 576 49. формула ,изобретения Составитель А.бражниковаРедактор В.Пилипенко Техред Т. Маточка Корректор А.Гриценко Заказ 3774/64 Тираж 883 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета, СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, ЖРаушская наб., д. 4/5 ае ее Е 4 Вфилиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Способ ингибирования синтеза рибосомных РНК путем инкубирования биологического материала с раствором ф .селенита натрия, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью ингибирования синтеза рибосомных РНК в нативных клетках, интактные бластодермы отде- ляют от желтка, инкубируют с селени" М том натрия, затем добавляют в инкубационную смесь Н -уридин в концент 3рации 40-50 мк Ки/млотмывают от невключившейся метки, добавляют РНК- носитель, уридии и контролируют степень ингибирования определением фракции РНК-ДНК,Источники ийформации,принятые во внимание при .экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР й 627162, кл. С 12 К 1/02, 1978.